[發明專利]PCR檢測中的消化探針及其試劑盒

在審

• 申請號: 202010782390.8
• 申請日: 2020-08-06
• 公開（公告）號: CN114058685A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 陳瑩;張奇;張穎;張曄
• 申請（專利權）人: 北京閱微基因技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

1.一種用于降低樣本中野生型DNA含量，提高突變型DNA豐度的消化探針設計方法，其特征是：

針對于每個待檢位點設置一組兩條探針，分別對應待檢位點的正鏈和負鏈；

探針與待檢測位點野生型DNA序列完全一致或互補，與突變型DNA序列不完全一致；

探針3’部分與待檢位點DNA結合能力較強，5’端與待檢位點DNA結合能力相對較弱；

其中不同位點對應的消化探針與對應野生型目的片段結合應有相同或相近的Tm值；

所述消化探針與野生型目的片段結合的Tm值設置高于消化探針與突變型DNA結合的Tm值，同時不同消化探針之間結合成雙鏈的Tm值要足夠低。

2.根據權利要求1所述的設計方法，所述探針的3’部分帶有提高雙鏈DNA穩定性的修飾。

3.根據權利要求1-2任一所述的設計方法設計得到的微衛星不穩定狀態檢測中的消化探針，其結構為：探針5’端-探針中部-探針3’端，

所述的探針5’端，為與對應位點對應目的片段單堿基重復序列3’端相鄰序列的互補堿基，長度0至3個堿基；

所述的探針中部，為與對應位點對應目的片段單堿基重復序列的互補堿基，堿基數量與對應位點野生型目的片段單堿基重復序列的重復數相同，或少一至兩個堿基；

所述的探針3’端，為與對應位點對應目的片段單堿基重復序列5’端相鄰序列的互補堿基，長度4至10個堿基。

4.根據權利要求1所述的消化探針，其中探針5’端，為與對應位點對應目的片段單堿基重復序列3’端相鄰序列的互補堿基，長度0-2個堿基；探針3’端，為與對應位點對應目的片段單堿基重復序列5’端相鄰序列的互補堿基，長度4-6個堿基，所述探針3’端區域堿基添加有修飾，或以修飾堿基取代正常堿基，所述修飾包括MGB修飾、熒光基團修飾、鎖核酸修飾、肽核酸修飾、磷酸化修飾、硫代磷酸化修飾、空間子修飾。

5.根據權利要求3所述的消化探針，所述修飾基團為LNA修飾。

6.根據權利要求5所述的消化探針，所述微衛星不穩定狀態檢測為以下6個單核苷酸重復位點中的一個或多個：NR21、NR24、BAT25、BAT26、NR27和MONO27。

7.根據權利要求5所述的消化探針，所述消化探針的序列為下表中的一對或多對探針序列示：

其中探針序列中的+為LNA修飾。

8.根據權利要求5所述的消化探針，所述消化探針的序列改動1-3個堿基，或者其3’端末端進行改動；所述改動包括替換、增加或刪除一個或更多個堿基，同時保留其與目的片段特異性結合的能力。

9.一種PCR檢測試劑盒，含有權利要求1-6任一所述的消化探針，和擴增目的片段的引物組合物。

10.根據權利要求9所述的檢測試劑盒，所述目的片段為微衛星不穩定狀態檢測的6個單核苷酸重復位點：NR21、NR24、BAT25、BAT26、NR27、MONO27和3個對照位點；

所述消化探針的序列如下表如示：

其中探針序列中的+為LNA修飾；

所述引物組合物為：

NR-21引物：

正向引物：5’-GAGTCGCTGGCACAGTTCTA-3’，

反向引物：5’-FAM-ATATTCCTACTCCGCATTCACAC-3’，

NR-24引物：

正向引物：5’-TTGCTGAATTTTACCTCCTGAC-3’，

反向引物：5’-TAMAR-ATTGTGCCATTGCATTCCAA-3’，

NR-27引物：

正向引物：5’-GGAAACAAAGCATTGAAGTCTGCAGT-3’，

反向引物：5’-HEX-GAGGTTCTGAGTCGATAATACTAGC-3’，

BAT-25引物：

正向引物：5’-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3’，

反向引物：5’-HEX-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3’，

BAT-26引物：

正向引物：5’-GGACAGTTTGAACTGACTACTT-3’，

反向引物：5’-FAM-AGCTCCTTTATAAGCTTCTTCAGT-3’，

MONO-27引物：

正向引物：5’-GAAATGGTGGGAACCCAG-3’，

反向引物：5’-TAMAR-GGTGGATCAAATTTCACTTGG-3’，

PentaC引物：

正向引物：5’-CTGCCACACAGTTTCCTCCT-3’，

反向引物：5’-FAM-ACTGAGCGCTTCTAGGGACTT-3’，

PentaD引物：

正向引物：5’-AGTAGGATCACTTGAGCCTGGAA-3’，

反向引物：5’-HEX-ATGATTCTCTTTTTTTCCCCTTCG-3’，

Amel引物：

正向引物：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’，

反向引物：5’-TAMAR-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’。