[發明專利]一種檢測SMN1拷貝數的熒光定量擴增體系及試劑盒

在審

• 申請號: 202010782028.0
• 申請日: 2020-08-06
• 公開（公告）號: CN111944890A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 陳瑩;張奇;王怡慧;張穎;張曄
• 申請（專利權）人: 北京閱微基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

本發明涉及一種檢測SMN1拷貝數的熒光定量擴增體系及試劑盒。本發明與常規熒光定量PCR方法類似地，只是在擴增體系中還有一條用于抑制SMN2擴增和/或產生熒光信號的Blocker。Blocker與探針同方向，可特異性結合SMN2。抑制SMN1同源基因SMN2目標區域的非特異性擴增。該體系可提高擴增檢測SMN1基因的特異性，提高對SMN1基因拷貝數定量能力，實現對0、1、2及更多拷貝的有效區分。本發明的試劑盒可穩定、準確、簡便地對SMN1基因Exon7和Exon8的拷貝數進行準確定量，實現對SMA患者、攜帶者和正常人的檢測。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種體外檢測運動神經元存活基因(Survival of Motor Neuron，SMN1)拷貝數PCR體系及檢測試劑盒。

背景技術

脊髓性肌萎縮癥，Spinal muscular atrophy(SMA)，是一種脊髓前角運動神經元變性導致肌無力、肌萎縮常染色體隱性遺傳病。SMA的攜帶率和發病率在各人種中基本相同，攜帶者頻率1/40～1/60，新生兒中發病率約4～10/100,000。正常情況下人類機體會正常表達SMN蛋白，來維護脊髓前角細胞功能。當SMN蛋白表達下降甚至消失后，將導致脊髓前角細胞變性，從而使個體身體軀干和四肢近端骨骼肌進行性肌無力、肌萎縮，即脊髓性肌萎縮癥(SMA)。

SMA的致病基因定位于五號染色體5q13.2區域。該區域整體呈現為一個巨大的反向重復結構，這也導致該區域內容易發生非等位基因間同源重組，造成基因缺失或重復等異常。

在該區域上的兩個高度同源的基因被命名為運動神經元存活基因(survivalmotor neuron,SMN)。研究發現，靠近端粒的SMN1是SMA的致病性基因。如果兩個SMN1基因拷貝全部缺失或帶有致病性突變則會導致SMA；靠近中心體的SMN2不是SMA致病性基因，但其拷貝數與SMA臨床表現嚴重程度相關。

SMN基因全長20kb，含有9個外顯子(1、2a、2b、3-8)。SMN1和SMN2基因序列在包括啟動子在內的全部基因區域高度一致。一般認為SMN1和SMN2基因只有5個堿基的區別，它們分布在內含子6到外顯子8之間的區域內。SMN1和SMN2基因所有外顯子序列僅存在兩個堿基不同，其一是外顯子7中的一個不同堿基(Exon 7+6，第840堿基，C/T)，該堿基為同義突變；其二是外顯子8中的一個不同堿基(Exon 8+245，G/A)，該堿基位于終止密碼子后，對蛋白編碼無影響。因此，SMN1和SMN2所編碼的氨基酸序列是完全一致的。

SMN基因轉錄產物長約1.7kb，編碼294個氨基酸的SMN蛋白，參與構成與RNA加工有關的多蛋白復合體。SMN蛋白在人體組織中普遍表達，脊髓前角運動神經元對其需求較高，若SMN蛋白表達水平過低，會使神經元死亡，導致肌肉的萎縮。

SMN1可以表達穩定、完整的功能的SMN蛋白。雖然SMN2與SMN1基因序列極為相近，但SMN2在體內轉錄出的大部分轉錄產物沒有正確剪接，僅有約10％的mRNA拼接正確并翻譯出具有正常活性SMN蛋白。大部分轉錄本缺失了第七外顯子，被稱作Δ7SMN2，這些蛋白缺乏正常SMN蛋白功能且會被很快降解。因此SMN2不能完全代償SMN1基因缺失或突變帶來的SMN蛋白的不足，但其拷貝數量會影響SMN1缺失SMA患者的疾病嚴重程度。

造成SMN1和SMN2剪接不同的原因，在于兩基因在7號外顯子上的一個堿基不同，外顯子7的第六位(Exon 7+6)即編碼區的840位核苷酸，在SMN1中為C而在SMN2中為T(840CT)。該堿基差異被認為影響了該區域剪切增強子的結構和功能，并最終造成RNA剪接方式的不同。所以該位置的堿基，840CT，是影響能否產生正常SMN蛋白的關鍵堿基，也是區分SMN1和SMN2功能差異的關鍵堿基。