[發明專利]一種小分子在促進胚胎干細胞自我更新中的應用方法

在審

• 申請號: 202010781920.7
• 申請日: 2020-07-31
• 公開（公告）號: CN111909892A
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 葉守東;汪鑫
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種小分子在促進胚胎干細胞自我更新狀態中的應用方法，其特征在于，在含有10％FBS的DMEM培養基中，加入Spautin-1小分子來維持小鼠胚胎干細胞自我更新的狀態。

2.根據權利1所述的方法，其特征在于，所述的小鼠胚胎干細胞在Spautin-1小分子條件下的傳代和培養：

(1)取1.5ml 0.1％濃度的明膠包細胞培養板，置于37℃、5％CO₂濃度的細胞培養箱，包板30min；

(2)取生長密度在70-80％的P24代小鼠胚胎干細胞，棄去培養液，用PBS緩沖液洗滌一次，除去殘留的培養液；

(3)加入1ml 0.1％濃度的胰蛋白酶，消化細胞2min左右，至細胞邊緣浮起，用移液器吹打細胞，吸取細胞懸液，轉移至盛有2ml DMEM血清培養液的15ml離心管中，繼續吹打混勻，終止消化；

(4)1000rpm，離心3min后，棄去上清，加入2ml DMEM培養液重懸細胞，利用細胞計數板計數，并以此計算出細胞密度；

(5)取出包好的培養板，棄去明膠，向培養板中加入2ml DMEM培養液；

(6)向兩組細胞培養板中分別加入4×10⁵個細胞，水平十字形晃動，使細胞分布均勻；

(7)向其中一組細胞培養板中分別加入1μM、2μM、3μM、4μM濃度Spuatin-1小分子處理的細胞，水平十字形晃動，使其混合均勻；

(8)向另一組細胞培養板中分別添加2μM Spautin-1+3μM CHIR99021小分子組合，以及2μM Spautin-1+1μM PD0325901小分子組合，水平十字形晃動，使其混合均勻；

(9)將細胞培養皿置于37℃、5％CO₂濃度的細胞培養箱內培養。

3.根據權利要求2中(7)所述的方法，其特征在于，加入的Spautin-1小分子為2μM時，為促進小鼠胚胎干細胞自我更新的最佳處理濃度。

4.根據權利要求2中(8)所述的方法，其特征在于，加入Spautin-1與CHIR99021兩種小分子組合或Spautin-1與PD0325901兩種小分子組合均能夠維持小鼠胚胎干細胞的自我更新狀態。

5.根據權利要求1所述一種小分子在促進小鼠胚胎干細胞自我更新狀態中的應用方法，其特征在于，細胞自我更新狀態與細胞特性檢測方法如下：

(1)形態觀察，使用Leica DMIL倒置顯微鏡分別對添加不同濃度Spautin-1進行處理的小鼠胚胎干細胞進行觀察選擇最佳培養濃度；

(2)使用Leica DMIL倒置顯微鏡分別對負對照組(不添加小分子)、正對照組(僅添加Spautin-1小分子)以及實驗組A(添加Spautin-1+CHIR99021兩種小分子)、實驗組B(添加Spautin-1+PD0325901兩種小分子)的細胞形態進行觀察；

(3)堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)染色檢測自我更新狀況，具體方法如下：

a、正、負對照組和實驗組接種適量的細胞，培養一定時間后即可進行AP染色；

b、按照AP染色試劑盒說明配制BCIP/NBT染色工作液；

c、棄去細胞培養板中的培養液，用PBS洗滌3-5次，每次3-5min，加入500μl 4％的多聚甲醛固定細胞1-2min，棄去固定液，再用PBS洗滌3-5次，每次3-5min；

d、最后一次洗滌完畢后，去除洗滌液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，確保能充分覆蓋細胞；

e、室溫避光孵育30min或更長時間(可長達24小時)，直至顯色至預期深淺；

f、去除BCIP/NBT染色工作液，用PBS洗滌1-2次即可終止顯色反應；

g、最后加入適量PBS后，將培養板放在Leica DMIL倒置顯微鏡觀察負對照組(不添加小分子)、正對照組(僅添加Spautin-1小分子)與實驗組A(添加Spautin-1+CHIR99021兩種小分子)和實驗組B(添加Spautin-1+PD0325901兩種小分子)細胞染色情況，判斷細胞自我更新狀態。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述DMEM包括以下組分：10％FBS，1％MEM非必需氨基酸，2mM L-Glutamin，0.1mMβ-巰基乙醇，1mM丙酮酸鈉，100單位的青霉素和100μg的鏈霉素。