[發明專利]一種小分子在促進胚胎干細胞自我更新中的應用方法

在審

• 申請號: 202010781920.7
• 申請日: 2020-07-31
• 公開（公告）號: CN111909892A
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 葉守東;汪鑫
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種小分子在促進胚胎干細胞自我更新中的應用方法，能確保小鼠胚胎干細胞在此種培養條件下長期處于自我更新狀態且具有多能性。本發明所述的培養基組成成份為小鼠胚胎干細胞基礎培養基，含10％FBS，1％MEM非必需氨基酸，2mM L?Glutamin，0.1mMβ?巰基乙醇和1mM丙酮酸鈉，同時添加Spautin?1+PD0325901或Spautin?1+CHIR99021任意組合。與傳統添加LIF培養基相比，本發明的新型培養條件減少了外源性動物源性細胞因子的添加，且能達到穩定的培養效果。本發明所摸索出的培養條件，可以為改善和提高目前小鼠胚胎干細胞，同時為優化他種類型的干細胞的培養條件提供了線索。

技術領域

本發明涉及一種小分子在促進胚胎干細胞自我更新中的應用方法。

背景技術

胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)來源于植入前囊胚期的內細胞團，體積小，形態與早期胚胎細胞相似，細胞核大，在體外抑制分化培養，細胞排列緊密，細胞邊緣清晰，呈集落狀生長。在體外培養條件下能夠無限增殖(自我更新)，且在一定條件下能夠被誘導分化為神經細胞、造血干細胞、內皮層細胞等幾乎所有細胞類型(多能性)。因此，胚胎干細胞常作為研究動物細胞組織分化、胚胎發生、細胞信號網絡調控等發育生物學基礎研究的一個非常有用的工具。胚胎干細胞體外培養條件下的自我更新能力保證了干細胞研究和應用所需要的大量細胞，而多能性擴展了干細胞在多領域的應用前景和價值。小鼠胚胎干細胞(mouse ESCs，mESCs)是最早建立的干細胞系，小鼠與人胚胎干細胞(human ESCs，hESCs)擁有眾多的相似之處，常作為人類疾病研究的良好模型，解決了研究人胚胎干細胞所帶來的倫理道德問題。但人胚胎干細胞體外培養的工序繁瑣，成本較高，是目前所要解決的難題。而小鼠胚胎干細胞的體外培養需要特定的營養物質和眾多細胞因子的參與，若無這些因子細胞會出現分化現象，從而失去自我更新和多向分化的潛能。所以以小鼠胚胎干細胞為模型，篩選有利于胚胎干細胞體外維持的條件，特別是無動物血清成份的因素(如小分子化合物)，將有助于優化當前不同哺乳動物胚胎干細胞體外維持未分化狀態的培養條件。前期我們發現小分子Spautin-1可以促進小鼠胚胎干細胞自我更新的狀態，這將為避免小鼠胚胎干細胞在培養過程中出現分化問題提供了一個新途徑。

Spautin-1小分子是一種細胞自噬抑制劑，抑制泛素特異性肽酶10(USP10)和USP13的活性.。前期有研究發現Spautin-1通過抑制細胞自噬作用，增強了幾種癌癥的靶向治療和傳統化學放療的抗癌活性，因此可以作為一種新型藥物，對某些癌癥具有潛在治療意義。

將Spautin-1小分子加入小鼠胚胎干細胞的培養體系，我們發現Spautin-1在最適濃度下，能夠在不添加一些細胞因子的條件下短暫地促進小鼠胚胎干細胞的自我更新。進一步研究發現，僅使用Spautin-1和CHIR99021兩種小分子組合或Spautin-1和PD0325901兩種小分子組合均可促進小鼠胚胎干細胞自我更新，作為一種干細胞培養的新因素，有望優化未來其他哺乳動物或其他類型干細胞的體外培養條件。

發明內容

本發明所要解決的發現小鼠胚胎干細胞新的培養條件，提供一種小分子在促進小鼠胚胎干細胞自我更新中的應用方法，從而為其他動物的胚胎干細胞培養提供新的策略。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是在含有10％FBS基礎上，摸索Spautin-1最適培養濃度，通過加入Spautin-1與CHIR99021兩種小分子組合或者Spautin-1與PD0325901兩種小分子組合來促進小鼠胚胎干細胞的自我更新。

本發明的具體操作，包括以下步驟：

(1)取1.5ml 0.1％濃度的明膠包細胞培養板，置于37℃、5％CO₂濃度的細胞培養箱，包板30min；

(2)取生長密度在70-80％的小鼠胚胎干細胞，棄去培養液，用PBS緩沖液洗滌一次，除去殘留的培養液；