[發明專利]艱難梭菌檢測引物或雙重檢測引物組及其試劑盒和快速檢測方法

在審

• 申請號: 202010781656.7
• 申請日: 2020-08-06
• 公開（公告）號: CN111826453A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 崔立;徐騰;陳云波;張建華
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/145
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 余瑩

本發明提供準確快速檢出艱難梭菌毒素B的RPA引物及包含所述引物的試劑盒和艱難梭菌毒素B的檢測方法，進而通過檢測艱難梭菌毒素B篩查艱難梭菌致病菌，以及用于艱難梭菌雙重檢測的RPA引物組及其試劑盒和同時檢測艱難梭菌及艱難梭菌毒素B的檢測方法，通過構建艱難梭菌雙重RPA檢測試劑盒一步鑒定被艱難梭菌致病菌株污染的樣品，以便用于基層和野外疑似樣品的現場診斷。本發明通過檢測艱難梭菌毒素B而快速檢出艱難梭菌致病菌的RPA引物包括CDB上游引物SEQ ID No.1和CDB下游引物SEQ ID No.2，艱難梭菌雙重RPA檢測引物組還包括CD上游引物SEQ ID No.3和CD下游引物SEQ ID No.4。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及用于艱難梭菌毒素B檢測的RPA引物及包含所述引物的試劑盒和艱難梭菌毒素B的快速檢測方法，進而通過檢測艱難梭菌毒素B篩查艱難梭菌致病菌，以及包含所述用于艱難梭菌毒素B檢測的RPA引物的用于艱難梭菌雙重檢測的RPA引物組及其試劑盒和同時檢測艱難梭菌及艱難梭菌毒素B的快速檢測方法。

背景技術

艱難梭菌(Clostridium difficile)又稱難辨梭菌、困難梭菌，因嚴格厭氧且難以分離培養而得名。一般認為艱難梭菌是環境和人類腸道中的正常菌群，但是在長期應用抗生素或免疫抑制劑等情況下，臨床耐藥艱難梭菌產毒株可過度繁殖并釋放毒素從而導致艱難梭菌相關性腹瀉，嚴重者可引發偽膜性腸并常伴有中毒性巨結腸和腸穿孔等并發癥，甚至最終導致死亡。艱難梭菌感染不僅是歐美國家最常見的醫療保健機構相關性感染，而且正威脅著全球的公共衛生安全，調查研究表明，常見的肉類、蔬菜和牛奶等食品均可能被艱難梭菌污染，因而可通過飲食途徑感染人類。目前已鑒定的艱難梭菌毒素有毒素A、毒素B、毒素C、毒素R、毒素E和二元毒素等。臨床上大量檢測結果表明，國內外引起臨床癥狀的產毒艱難梭菌毒素種類主要為毒素A和毒素B，且分離鑒定的致病菌株基本均為毒素B陽性(A^-B⁺，A⁺B⁺)菌株，國內臨床鮮見毒素B陰性(A⁺B^-，A^-B^-)產毒株報道，大部分艱難梭菌致病菌都為毒素B陽性菌株。因此，臨床篩查以分離鑒定或基因檢測毒素B為主，若臨床鑒別篩查出具有艱難梭菌毒素B，則證明該菌株為艱難梭菌致病菌株。

艱難梭菌感染的臨床檢測“金標準”仍然為細胞毒性試驗和產毒素培養，但是由于艱難梭菌培養條件極其苛刻、實驗過程耗時較長等原因，這兩種方法難以適應臨床快速診斷和大規模流行病學調查需求，因此，隨后發展出了酶聯免疫法，該方法的特異性高，能區分產毒株和不產毒株，并且檢測周期短，數小時即可出結果，目前已有多種商品化試劑盒投入使用。但是該方法靈敏度不夠的缺點，與前兩種方法一樣，不適用于大規模篩查食品中微量感染艱難梭菌的情況，因此，目前越來越多的采用核酸擴增方法來輔助診斷或開展流行病學調查，具有用時短、結果易判斷等特點。

重組酶聚合酶擴增技術(RPA)是近年發展起來的一種基于核酸擴增的分子檢測技術，相比于常見的普通PCR和定量PCR方法，RPA不僅同樣具有快速、特異和靈敏度高的特點，而且擴增時間更短、擴增溫度低和操作簡便，擺脫了對實驗室條件、設備以及專業技術的依賴，特別適用于基層醫院的快速診斷和食品污染等現場快速篩查。

發明內容

本發明針對上述缺陷，提供準確快速檢出艱難梭菌毒素B的RPA引物及包含所述引物的試劑盒和艱難梭菌毒素B的檢測方法，進而通過檢測艱難梭菌毒素B篩查艱難梭菌致病菌，以及包含所述用于艱難梭菌毒素B檢測的RPA引物的用于艱難梭菌雙重檢測的RPA引物組及其試劑盒和同時檢測艱難梭菌及艱難梭菌毒素B的檢測方法，通過構建艱難梭菌雙重RPA檢測試劑盒一步鑒定被艱難梭菌致病菌株污染的樣品，以便用于基層和野外疑似樣品的現場診斷。

本發明提供如下技術方案：用于檢測艱難梭菌毒素B的RPA引物，其特征在于，所述的RPA引物是基于艱難梭菌毒素B基因設計的，包括：

CDB上游引物SEQ ID No.1：