[發明專利]艱難梭菌檢測引物或雙重檢測引物組及其試劑盒和快速檢測方法

在審

• 申請號: 202010781656.7
• 申請日: 2020-08-06
• 公開（公告）號: CN111826453A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 崔立;徐騰;陳云波;張建華
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/145
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 余瑩

1.用于檢測艱難梭菌毒素B的RPA引物，其特征在于，所述的RPA引物是基于艱難梭菌毒素B基因設計的，包括：

CDB上游引物SEQ ID No.1：

5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；

CDB下游引物SEQ ID No.2：

5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'。

2.用于檢測艱難梭菌毒素B的RPA試劑盒，其特征在于，包括如下RPA反應擴增體系組成：

2.4μL CDB上游引物SEQ ID No.1：

5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；

2.4μL CDB下游引物SEQ ID No.2：

5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；

25μL反應緩沖液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去離子水；2.5μL核心反應混合液；2.5μL醋酸鎂溶液；1μL待測DNA模板。

3.根據權利要求2所述的用于檢測艱難梭菌毒素B的RPA試劑盒，其特征在于，所述CDB上游引物的濃度為10μM，所述CDB下游引物的濃度為10μM，所述dNTPs的濃度為2.5mM，所述醋酸鎂溶液的濃度為280mM。

4.根據權利要求2或3所述的用于檢測艱難梭菌毒素B的RPA試劑盒，其特征在于，所述RPA反應擴增片段為225bp。

5.一種檢測艱難梭菌毒素B的RPA方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待測樣品總DNA；

2)采用1μL所述步驟1)提取的所述待測樣品總DNA；

2.4μL CDB上游引物SEQ ID No.1：

5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；

2.4μL CDB下游引物SEQ ID No.2：

5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；

25μL反應緩沖液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去離子水；2.5μL核心反應混合液；2.5μL醋酸鎂溶液構成共50μL的反應擴增體系，于39℃恒溫下進行RPA擴增反應20min；

3)根據擴增反應結果確定所述待測樣品中是否含有艱難梭菌毒素B。

6.包括權利要求1所述的用于檢測艱難梭菌毒素B RPA引物的用于艱難梭菌雙重檢測的RPA引物組，其特征在于，所述RPA引物組還包括針對艱難梭菌tpi基因設計的RPA引物，引物序列如下：

CD上游引物SEQ ID No.3：

5'-CTTTCTTGTTTACAGTTTCATCAGTTTCATTG-3'；

CD下游引物SEQ ID No.4：

5'-CATTTACAGGAGAAGTTTCACCTCTTATGTT-3'。

7.用于艱難梭菌雙重檢測的RPA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒可以同時檢測艱難梭菌和艱難梭菌毒素B，

包括如下RPA反應擴增體系組成：

1.35μL CDB上游引物SEQ ID No.1：

5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；

1.35μL CDB下游引物SEQ ID No.2：

5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；

1.05μL CD上游引物SEQ ID No.3：

5'-CTTTCTTGTTTACAGTTTCATCAGTTTCATTG-3'；

1.05μL CD下游引物SEQ ID No.4：

5'-CATTTACAGGAGAAGTTTCACCTCTTATGTT-3'；

25μL反應緩沖液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去離子水；2.5μL核心反應混合液；2.5μL醋酸鎂溶液；1μL待測DNA模板。