[發(fā)明專利]一種大腸桿菌O157核酸檢測(cè)質(zhì)粒DNA參考樣品、制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010781186.4
• 申請(qǐng)日: 2020-08-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111876504A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳瑤;許龍巖;袁慕云;郝文波;劉二龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/689
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/689;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 北京東方盛凡知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11562
• 代理人: 張換君

本發(fā)明公開(kāi)了一種大腸桿菌O157核酸檢測(cè)質(zhì)粒DNA參考樣品、制備方法及其應(yīng)用，屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，該參考樣品采用包含來(lái)源于不同大腸桿菌O157菌株的uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7基因的片段插入質(zhì)粒中形成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，各基因以1:1比例串聯(lián)，基因間以不相關(guān)的基因片段進(jìn)行隔開(kāi)；本參考品包含明確的udiA、rf bE、flicH7、Stx1、Stx2、eaeA六種檢測(cè)基因，序列來(lái)源清晰，而且均按照單拷貝方式保存于質(zhì)粒中，不僅可以用于定性檢測(cè)，還可以作為量值可溯源的參考品進(jìn)行試劑性能鑒定和實(shí)驗(yàn)室之間能力評(píng)價(jià)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種大腸桿菌O157核酸檢測(cè)質(zhì)粒DNA參考樣品、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

大腸桿菌O157在世界范圍內(nèi)引起廣泛的食物中毒，而大腸桿菌O157的診斷需要多種信息，例如基因型，侵襲和毒力等。但是，諸多檢測(cè)需要的靶基因并不是均勻的分布在單一菌株中。在實(shí)際操作中，如果需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，或者就多個(gè)基因的檢測(cè)能力在不同的實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行能力評(píng)價(jià)，則需要使用多個(gè)菌株的基因組分別制備多條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。鑒于生物檢測(cè)受到質(zhì)量控制和數(shù)量可追溯性的總體水平的限制，能夠涵蓋廣泛的檢測(cè)靶標(biāo)，并且具有量值和序列可追溯性的參考品符合實(shí)際需求。

rfbE基因編碼大腸桿菌O157的表面抗原。flicH7是編碼H7型抗原的特定基因，H7型抗原是大腸桿菌的鞭毛抗原的53種類(lèi)型之一。靶向rfbE基因可以確定測(cè)試菌株是否為O157，而檢測(cè)flicH7可以確定該菌株是否攜帶H7型鞭毛抗原。eaeA，stx1和stx2基因是大腸桿菌O157的重要毒力基因，并且是判斷菌株致病性的重要依據(jù)。Schmidt等人根據(jù)不同的毒力基因?qū)⒋竽c埃希氏菌eO157血清群分為三個(gè)不同的病原體組：1.具有stx和eaeA的O157：H7和O157：H菌株組；2.具有幾種不同的H抗原的O157大腸菌表達(dá)K88菌毛并產(chǎn)生腸毒素；3.Stx陰性，與eaeA基因和EPEC粘附因子(EPEC粘附因子，EAF)有關(guān)，與嬰兒腹瀉有關(guān)。通過(guò)一系列毒力，鞭毛和H表面抗原基因的檢測(cè)，可以對(duì)大腸桿菌O157進(jìn)行致病性分類(lèi)。

目前，試劑盒中包含的用作實(shí)時(shí)定量PCR的質(zhì)量控制品有臨床陽(yáng)性樣本、提取的基因組、自行開(kāi)發(fā)的DNA分子或陽(yáng)性參考品等。臨床陽(yáng)性樣品不容易獲得，并且缺乏穩(wěn)定性和安全性。從單一菌株提取的基因組參考品(gDNA)通常不能均勻覆蓋所有檢測(cè)目標(biāo)，在量值上也不能穩(wěn)定溯源。自行開(kāi)發(fā)的DNA參考僅包含單個(gè)基因的小片段，并且不具有不同試劑盒的兼容性。

質(zhì)粒DNA參考品(pDNA)是一種新興的生物參考品，具有純度高，穩(wěn)定性好，開(kāi)發(fā)成本低的優(yōu)點(diǎn)。它不僅可以用作核酸檢測(cè)的定性陽(yáng)性對(duì)照，還可以用作定量標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)在核酸檢測(cè)的可追溯性過(guò)程中也起著關(guān)鍵作用。依靠發(fā)達(dá)的合成平臺(tái)，可以容易地從生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)和制備各種長(zhǎng)度的雙鏈DNA片段，并應(yīng)用于廣泛的基因工程研究。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

本發(fā)明提供一種大腸桿菌O157核酸檢測(cè)質(zhì)粒DNA參考樣品，采用包含來(lái)源于不同大腸桿菌O157菌株的uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7全長(zhǎng)基因的片段插入質(zhì)粒中形成；

所述大腸桿菌O157核酸檢測(cè)質(zhì)粒DNA參考樣品的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7基因以1:1比例串聯(lián)；

所述uidA、eaeA、Stx1、Stx2、rfbE和flicH7基因間以不相關(guān)的基因片段進(jìn)行隔開(kāi)。

進(jìn)一步地，所述大腸桿菌O157核酸檢測(cè)質(zhì)粒DNA參考樣品在260nm和280nm處的光密度值比值在1.8-2.0之間。

進(jìn)一步地，所述不相關(guān)的基因片段的核苷酸序列為aagtcg。