[發明專利]一種沙門氏菌核酸檢測質粒DNA參考樣品、制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202010781165.2
• 申請日: 2020-08-06
• 公開（公告）號: CN111850150A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 袁慕云;許龍巖;陳瑤;郝文波;劉二龍
• 申請（專利權）人: 廣州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/10;C12N15/63;C12N15/31;C12R1/42
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 張換君

本發明公開了一種沙門氏菌核酸檢測質粒DNA參考樣品、制備方法及其應用，屬于微生物檢測領域，該參考樣品采用包含來源于沙門氏菌的腸傷寒特異性序列se、鼠傷寒特異性序列st以及共有的aceA基因的片段插入質粒中形成，各基因以1:1:1比例串聯，基因間以不相關的基因片段進行隔開；本參考品包含明確的se、st、aceA三種檢測基因片段，序列來源清晰，而且均按照單拷貝方式保存于質粒中，不僅可以用于定性檢測，還可以作為量值可溯源的參考品進行試劑性能鑒定和實驗室之間能力評價。

技術領域

本發明涉及微生物檢測領域，特別是涉及一種沙門氏菌核酸檢測質粒DNA 參考樣品、制備方法及其應用。

背景技術

沙門菌(salmonella,Sa)屬于腸桿菌科，是威脅人類及動物健康的食源性致病微生物，能夠引起傷寒、副傷寒、腸胃炎及敗血癥等嚴重疾病。在世界各國細菌性食物中毒病例中，其引起的食物中毒常居榜首或第二位。沙門氏菌在日常生活中非常常見，如在生雞蛋殼、家禽，紅肉中，除此之外，被污染的水是全世界沙門氏菌的主要來源。有數據已經證實在發展中國家約有2000萬人感染沙門氏菌，同樣的在美國，德國等國家也是沙門氏菌的多發地。沙門氏菌的血清型有超過2500種，但是英國的一項調查表明，腸炎沙門菌(salmonellaenteritidis,SE)和鼠傷寒沙門菌(salmonella typhimurium,ST)感染占到人類Sa 感染患者的75％以上。因此，快速鑒定并確定沙門氏菌的型別，對食品安全具有重要的意義。

目前沙門氏菌的檢測方法在不斷的快速發展中，聚合酶鏈式反應(PCR)等核酸檢測技術的不斷提升一定程度的克服了傳統檢測方法耗時長、操作復雜、特異性差等缺點。基于核酸的檢測特異性強、靈敏度高、快速等優點已成為食源性病原微生物常規的檢測方法之一，在食源性病原微生物檢測中發揮著重要的作用。但是目前用于PCR的陽性核酸參考品十分缺乏。要同時進行沙門氏菌的鑒定和型別分析，往往要使用多個基因組參考品才能完成，而基因組參考品中檢測靶基因的量值，又難以確定和溯源，因此使用基因組DNA作為參考品，缺點是難以同時為多個靶標提供可溯源的定量參考。因此在檢測效果和實驗室結果評價方面存在嚴重不足。

質粒DNA參考物質(pDNA)是一類含有所檢測目的基因的特異性片段的重組質粒分子，具有穩定性好、準確度高的特點。它不僅可以在核酸的定性檢測中作為陽性對照，還可在定量分析中作為定量標準，構建定量分析的標準曲線。因此，質粒DNA參考物質在核酸檢測的可追溯性過程中也可起到關鍵作用。

發明內容

本發明的目的是提供一種沙門氏菌核酸檢測質粒DNA參考樣品、制備方法及其應用，以解決上述現有技術存在的問題。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

本發明提供一種沙門氏菌核酸檢測質粒DNA參考樣品，其核苷酸序列如 SEQ IDNo.1所示；

其采用包含來源于不同沙門氏菌菌株的se、st、aceA基因的片段插入質粒中形成；

所述se、st、aceA基因以1:1:1比例串聯；

所述se、st、aceA基因間以不相關的基因片段進行隔開。

進一步地，在260nm和280nm處的光密度值比值在1.8-2.0之間。

進一步地，所述不相關的基因片段的核苷酸序列為aagtcg。

本發明還提供一種上述的沙門氏菌核酸檢測質粒DNA參考樣品的制備方法，包括：

人工合成沙門氏菌基因se、st、aceA，基因之間用所述不相關的基因片段間隔；

合成后克隆插入質粒中，經沙門氏菌擴增后，提取并提純質粒；

測定濃度并分裝；-70℃預凍，經升華和再干燥后，得到凍干粉，即所述沙門氏菌核酸檢測質粒DNA參考樣品。