[發明專利]雄激素受體剪接變異體-7核酸定量檢測方法、內標及試劑盒

在審

• 申請號: 202010779376.2
• 申請日: 2020-08-05
• 公開（公告）號: CN112029855A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 王曉楠;喬春曉;張亞楠
• 申請（專利權）人: 上海思路迪醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京市蘭臺律師事務所 11354
• 代理人: 張峰

本發明公開了雄激素受體剪接變異體?7核酸定量檢測方法、內標及試劑盒。所述試劑盒包括AR?V7定量檢測相關的引物探針組合、內標以及AR?V7 RT?PCR法檢測相關試劑。且所述試劑盒可在單管內完成AR?V7的定量檢測，定量結果準確，極大的簡化了常規的定量操作流程，提高了效率，也降低了檢測失誤的風險。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，特別是涉及及一種人雄激素受體剪接變異體-7核酸定量檢測方法、內標及試劑盒。

背景技術

前列腺癌是一種常見的惡性腫瘤，并且是造成男性腫瘤死亡的第二大病因。近年來，我國前列腺癌的發病率呈逐年快速上升趨勢，2004年為5.8/10萬人，到2009年己經上升為8/10萬人。由于我國對前列腺癌易感人群的篩查工作相對落后，導致晚期前列腺癌約占初次診斷的前列腺癌的70％，我國初診為晚期前列腺癌的比例遠高于歐美國家(20-30％)。雄激素剝奪治療(Androgen deprivation therapy，ADT)是這類前列腺癌患者的最主要治療方法。盡管在ADT治療初期前列腺癌被不同程度的控制，但經過一段時間的治療后，大部分患者的疾病逐漸且不可逆地進展為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostate cancer，CRPC)。

目前已有的藥物阿比特龍與蒽雜魯胺對于CRPC患者的治療有較好的效果，但仍然有20％-40％的患者PSA維持在較高的水平，卻沒有明顯的療效，且多數經阿比特龍與蒽雜魯胺治療的患者后期幾乎都會發生獲得性的耐藥。關于阿比特龍與蒽雜魯胺耐藥的機制，文獻資料顯示，雄激素受體信號通路的異常屬于耐藥發生的可能機理之一，其中AR-V7是雄激素受體(AR)異常剪接所產生的構體，AR-V7由于缺少配體結合區，可以不依賴雄激素的結合而對下游的信號通路進行持續的活化，引起細胞的異常增殖。進一步的研究也表明，AR-V7陽性與經阿比特龍與蒽雜魯胺治療的CRPC患者的PSA響應率以及存活率呈明顯的負相關。因此AR-V7的檢測在表征CRPC患者治療效果方面具有重要意義。

關于AR-V7的檢測，目前市場上已有的僅用于科研服務的產品是凱杰公司生產的Adna Test Prostate Cancer Panel，檢測的大概流程是：首先采用磁珠法捕獲病人的循環腫瘤細胞(CTC)，之后進行mRNA的分離提取以及逆轉錄，最后通過qRT-PCR法完成AR-V7的定性檢測，并不進行定量。

AR-V7常規的定量方法主要包括：ddPCR檢測直接進行定量以及qPCR檢測利用標準曲線進行定量。ddPCR檢測比較明顯的劣勢在于操作流程繁瑣，時間長，成本高。qPCR標準曲線定量，每次試驗均需對標準曲線的配置與檢測，操作繁瑣。本發明提供的AR-V7定量檢測試劑盒則可以在單管內實現AR-V7的定量檢測，操作更加簡單、快捷，且成本更低。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明通過單管內同步檢測AR-V7以及AR-V7的內標(AR-V7 QS)，利用AR-V7 Ct值與AR-V7 QS Ct值的差值即ΔCt來對AR-V7進行定量。通常條件下，引物不同，則會導致引物的擴增效率不同，本發明提供的AR-V7與AR-V7 QS檢測共用上下游引物，探針的設計堿基組成相同而排列順序不同，進一步最大限度的保證了二者具有相同的擴增效率，從而可以直接利用ΔCt來直接對AR-V7進行定量。

為實現以上目的，本發明所采用的技術方案包括：

本發明提供一種熒光PCR定量檢測AR-V7的方法，包括：

S1、提供一包括AR-V7和已知濃度或模板量的AR-V7 QS內標的熒光PCR反應體系；

所述熒光PCR反應體系還包括用于檢測AR-V7的上、下游引物及探針，以及用于檢測AR-V7 QS的上、下游引物及探針，其中用于檢測AR-V7的上、下游引物序列分別與用于檢測AR-V7 QS的上、下游引物序列相同；