[發明專利]一種楊樹落葉松楊珊銹菌單孢擴繁方法

在審

• 申請號: 202010777047.4
• 申請日: 2020-08-05
• 公開（公告）號: CN111763654A
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 尹佟明;周妍;戴美麗;李淑嫻;戴曉港;李小平
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發明公開了一種楊樹落葉松楊珊銹菌單孢擴繁方法，屬于微生物培養技術領域。本發明的方法包括種苗、采集感病葉片和菌種初繁、單孢系轉接和擴繁等步驟，包括：使用90mm的一次性培養皿，在培養皿底部墊兩張濾紙，加入3mL無菌水進行保濕。將病葉上的單孢子堆用移液槍離散至4μL的瓊脂水溶液中，將混有夏孢子堆的溶液打在具有感病能力的NL895的嫩葉上，接種完成后置于溫度為19℃，光周期為16h/24h的溫室中進行培養，待其發病后在進一步擴繁至足量，保存至4℃冰箱待用。本發明采用室內接種的方法，對銹菌進行葉盤法培養，可獲得分離的孢子堆，方法簡單高效，為更好地研究楊樹抗銹性提供純化單一的菌株。

技術領域

本發明屬于微生物培養技術領域，具體地說，涉及一種楊樹落葉松楊珊銹菌(Melampsora laricipopulina)單孢擴繁方法。

背景技術

楊樹在全球有廣泛栽培，因其生長快、適應性強，而且品種多，選育時間短，成為了防風固沙林、農田防護林、水土保持林和用材林的主要樹種。但是隨著大規模楊樹人工林的發展，諸多病害隨之流行，嚴重阻礙了楊樹的生長。尤其是楊樹葉銹病的發生，導致病害在楊樹林地傳播迅速，給楊樹種植園帶來巨大損失。導致楊樹葉銹病的一種落葉松楊珊銹菌是世界雜交楊樹上危害嚴重的一種病原菌，較成材而言，幼苗和幼樹的受害更重，病癥為葉背面出現淡黃色粉狀物，且引起樹苗提前落葉，嚴重降低其生長量，造成重大經濟損失，并且造成樹勢減弱，使楊樹抵御其他病蟲害以及自然災害的能力減弱。

近幾年，楊樹銹病開始得到廣泛的重視和研究，在研究其致病菌楊樹落葉松楊珊銹菌時，為獲得足量的樣本，研究人員通常直接從染病的楊樹葉片上刮取大量單孢子堆，由于這是一種混合菌系，對楊樹落葉松楊珊銹菌分子遺傳相關的研究極為不利，特別是研究其群體遺傳時，所用的菌需要獲得大量的純菌系，而現有技術中還沒有該病菌的人工大量擴繁其單孢系的良好方法，對該病菌許多研究具有很大的限制和影響。

楊樹銹病很多研究需要基于純的菌系開展，該菌是轉主寄主，0、I階段寄生于落葉松屬(Larix)，II、III階段寄生于青楊派、黑楊派及以這兩派為母本的雜交種上。并且只能在活的楊樹葉片上存活和繁殖，擴繁單孢系比較困難，國內外也沒有報道過落葉松楊珊銹菌單孢系的擴繁。因此現在亟需一套落葉松楊珊銹菌單孢擴繁體系，即得到純化后的菌系。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明所要解決的技術問題在于提供一種落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，方便快捷高效。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，包括：挑取染病楊樹葉上的落葉松楊珊銹菌單孢子堆接種到健康的楊樹葉上，繁殖后利用新的健康的楊樹葉擴繁，最終獲得大量的單孢系孢子粉。

進一步地，所述的楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，具體步驟包括：

1)種苗：取三到四周的易感染楊樹落葉松楊珊銹菌的楊樹組培苗進行煉苗；

2)菌種初繁：摘取步驟1)得到的楊樹苗的健康葉片，制成葉盤后用無菌水洗凈，挑取染病楊樹葉上的落葉松楊珊銹菌的單孢子堆接種到葉盤上培養，每個葉盤上只接種一個單孢子堆；

3)單孢系轉接：待葉盤發病后，分別將每個葉盤上生長的孢子挑接到若干個新的葉盤上進行培養；

4)按單孢系收集孢子粉；

5)單孢系噴接擴繁：將收集的孢子粉配制成孢子懸液，以噴霧的形式接種到多個新的葉盤上繼續培養，得到足夠的孢子粉。

進一步地，所述的葉盤的制備和接種后的培養方法為：摘取煉苗后的楊樹苗的葉片，去除主脈切成2×2cm的小方塊作為葉盤，無菌水洗凈，使葉背面朝上置于培養皿中，培養皿底部預先加入濾紙和無菌水保濕，接種后用封口膜封好培養皿進行培養。