[發明專利]一種楊樹落葉松楊珊銹菌單孢擴繁方法

在審

• 申請號: 202010777047.4
• 申請日: 2020-08-05
• 公開（公告）號: CN111763654A
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 尹佟明;周妍;戴美麗;李淑嫻;戴曉港;李小平
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

1.一種楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，其特征在于，包括：挑取染病楊樹葉上的落葉松楊珊銹菌單孢子堆接種到健康的楊樹葉上，繁殖后利用新的健康的楊樹葉擴繁，最終獲得大量的單孢系孢子粉。

2.根據權利要求1所述的楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，其特征在于，具體步驟包括：

1)種苗：取易感染楊樹落葉松楊珊銹菌的楊樹組培苗進行煉苗；

2)菌種初繁：摘取步驟1)得到的楊樹苗的健康葉片，制成葉盤后用無菌水洗凈，挑取染病楊樹葉上的落葉松楊珊銹菌的單孢子堆接種到葉盤上培養，每個葉盤上只接種一個單孢子堆；

3)單孢系轉接：待葉盤發病后，分別將每個葉盤上生長的孢子挑接到若干個新的葉盤上進行培養；

4)按單孢系收集孢子粉；

5)單孢系噴接擴繁：將收集的孢子粉配制成孢子懸液，以噴霧的形式接種到多個新的葉盤上繼續培養，得到足夠的孢子粉。

3.根據權利要求2所述的楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，其特征在于，所述的葉盤的制備和接種后的培養方法為：摘取煉苗后的楊樹苗的葉片，去除主脈切成2×2cm的小方塊作為葉盤，無菌水洗凈，使葉背面朝上置于培養皿中，培養皿底部預先加入濾紙和無菌水保濕，接種后用封口膜封好培養皿進行培養。

4.根據權利要求2所述的楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，其特征在于，所述步驟2)中接種的具體操作為：在洗凈的葉盤上均勻噴灑0.05％吐溫20，然后將病葉上邊緣清晰的單孢子堆用移液槍離散至4μL的0.1g/L瓊脂水溶液中，再用移液槍將混有夏孢子堆的瓊脂水溶液打在制備好的葉盤上。

5.根據權利要求2所述的楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，其特征在于，所述步驟3)具體為：用10mL一次性注射器的針管對準葉盤上的孢子粉，輕輕刮取孢子粉收集到高溫滅菌處理過的離心管內后加入1mL 0.1g/L的瓊脂溶液混勻，再分別轉接到若干個新的葉盤上，接種前，新葉盤噴灑0.005％吐溫20。

6.根據權利要求2所述的楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，其特征在于，所述步驟5)中，孢子懸浮液的配制方法為：將步驟4)收集的孢子粉懸浮在含0.005％吐溫20的0.1g/L瓊脂溶液中，混合至濃度為2mg/mL的夏孢子懸浮液，使用噴壺使孢子懸浮液以噴霧的形式接種到健康的楊樹葉盤上，進一步擴大單孢系的繁殖，得到足夠的孢子粉。

7.根據權利要求2所述的楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，其特征在于，步驟2)、3)和5)中，葉盤接種，后置于溫度為19℃，光周期為16h/24h的溫室中進行培養。

8.根據權利要求2所述的楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，其特征在于，所述步驟3)和步驟5)，在獲得的孢子量不夠時，分別可重復1～5代。

9.根據權利要求2所述的楊樹落葉松楊珊銹菌的單孢擴繁方法，其特征在于，步驟1)中所述易感染楊樹落葉松楊珊銹菌的楊樹組培苗的品種為NL895。