[發明專利]基于Fe3

在審

• 申請號: 202010776818.8
• 申請日: 2020-08-05
• 公開（公告）號: CN112129939A
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 李巧玉;施海梅;余紹寧
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/543;G01N21/64
• 代理公司: 浙江納祺律師事務所 33257
• 代理人: 應毓婷

本發明公開了基于Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂納米粒子富集和PSMA傳感器檢測前列腺癌外泌體的方法。其采用Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂納米顆粒對外泌體進行富集，然后構建發卡狀PSMA適配體傳感器通過測得熒光強度的改變對外泌體進行定量。利用此檢測方法可以成功區分前列腺癌細胞外泌體與正常前列腺細胞外泌體，檢出限9×10³個/μL。將該方法用于臨床前列腺癌病人血清樣本和正常人血清樣本，能快速、準確地檢測出前列腺癌病人，并得到傳統ELISA方法的驗證。本發明富集外泌體方法簡單快速，富集效率高，可以在8分鐘內完成外泌體富集，富集效率為91.5％。靈敏度高，特異性強，檢出限為9×10³個/μL，可以顯著性區分臨床前列腺癌病人與健康人。

技術領域

本發明應用于外泌體標記物檢測分析技術領域，涉及一種基于TiO₂和PSMA適配體對前列腺癌外泌體的快速準確分析測定。

背景技術

前列腺癌(PCa)是全球男性最常見的實體惡性腫瘤。在早期，它有很高的治愈率，因此，前列腺癌的治療依賴于早期診斷。前列腺特異抗原(PSA)是前列腺癌診斷的一種血清生物標志物。然而，雖然PSA具有很高的敏感性，但它的特異性很差，尤其是在血清PSA水平為2-10 ng/mL的男性中，因此，泌尿外科需要其他特異的PCa生物標志物。外泌體是由正常細胞和腫瘤細胞分泌的包裹在脂質雙層膜內的生物小泡，其大小從30到200納米不等。外泌體在細胞間通訊中發揮著不同的作用，在體液中廣泛存在，包括血液、尿液、唾液等。腫瘤外泌體包含腫瘤特異性蛋白、RNAs，并參與腫瘤的發生和病原體的擴散等。許多研究表明腫瘤外泌體是診斷癌癥的一種理想的標記物，但是目前其分離和檢測方法仍存在挑戰。超速離心是最常用的外泌體分離方法，但是步驟復雜，分離效率低。商用ELISA試劑盒基于免疫親和方法以CD-63,CD-9(外泌體表面抗體)等作為靶標分離和檢測外泌體，靈敏度高，但是過程復雜并且成本高昂。

TiO₂由于其與磷酸集團的可逆性結合作用，廣泛應用于磷酸肽段和蛋白的分離富集，而外泌體表面富含磷酸基團，因此可以采用TiO₂分離富集外泌體。有文獻報道TiO₂可以成功實現外泌體的富集，但是后續采用離心方法進行固液分離可能會損失大量外泌。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種快速、高靈敏、高特異性的檢測前列腺癌外泌體的方法。

本發明的技術方案具體介紹如下。

本發明提供一種基于Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂納米粒子富集和PSMA傳感器檢測前列腺癌外泌體的方法，包括如下步驟：

1)合成Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂納米粒子，與含前列腺細胞外泌體的樣本共孵育并磁性分離，實現外泌體的分離；

2)將分離得到的外泌體與前列腺特異性膜抗原(PSMA)傳感器共孵育，并獲得熒光強度信號，通過測得熒光強度的改變對外泌體進行定量。

進一步，步驟1)中，Fe₃O₄@SiO₂@TiO₂納米粒子制備方法如下：

將Fe₃O₄溶于乙醇、去離子水和氨水的混合物中，超聲，接著加入TEOS，室溫下連續攪拌反應，得到Fe₃O₄@SiO₂；