[發明專利]改良ATMT構建基因過表達哈茨木霉菌株在褐煤降解中的應用

在審

• 申請號: 202010775139.9
• 申請日: 2020-08-05
• 公開（公告）號: CN111944839A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 姚菁華;肖雷;晏崇偉
• 申請（專利權）人: 中國礦業大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;C10G1/00;C12R1/885
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• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種改良ATMT構建基因過表達哈茨木霉菌株在褐煤降解中的應用，內容包括基因過表達載體的構建、ATMT轉化以及高表達胞外酶哈次木霉在褐煤降解中的應用。pkd7?HYG原始質粒T?DNA區域含有TrpC啟動子—潮霉素抗性—TrpC終止子功能元件和組蛋白啟動子—RFP基因—組蛋白終止子功能元件，克隆出需要進行表達的基因替換掉RFP基因，構建重組質粒；通過改良ATMT將T?DNA區域插入到哈次木霉AH基因組DNA中，獲得轉化子，對轉化子進行驗證、篩選，進而進行褐煤降解驗證即可。本發明主要從構建基因過表達哈次木霉菌株，以獲得對于褐煤降解能力更強的菌株。本發明構建得到過表達菌株相應基因的表達量遠遠高于野生株。并且菌株經過繼代培養后，其基因高表達能夠穩定遺傳，為研究更多種類基因過表達菌株在褐煤降解中的應用提供方法。

技術領域

本發明設計基因工程領域，具體涉及一種通過改良的農桿菌介導的ATMT轉化方法得到基因過表達哈茨木霉菌株在褐煤降解中的應用。

背景技術

風化煤、褐煤等低階煤資源，在我國已探明的儲量就達到數千億噸,占全國煤炭儲量的近三分之一。其中褐煤是一種變質程度低、易風化自燃、發熱量低、含水量、含氧量及揮發分較高的年輕煤種，芳香族碳含量較低，并含有少量的氮和硫等元素。這些低價煤資源直接燃燒熱效率低,工業應用價值低，長期露天堆放，不僅造成能源的浪費，而且容易造成環境污染。因此，如何合理開發和充分利用褐煤及低階煤資源將是一個值得深入研究的課題。

煤炭作為資源，具有廣泛的用途，既可以作為能源，又可以提取有用的化工產品，60%以上的化工原料就來自煤炭，對經濟的發展起著重要的作用。作為能源，煤炭必須清潔高效利用，采用高溫、高壓等手段把煤轉變為液體、氣體等其它類燃料代替油類物質，就是其高效轉化利用的一種。而從煤炭中提取化工產品,通常采用的是物理的、化學的外加一定的壓力一定的溫度的條件下來進行。從煤炭轉化為油類物質和提取化工品的過程來看，成本較高、條件苛刻。而采用微生物轉化技術來處理煤炭，使之轉化成另一種產品，或者作為燃料，或者從中提取化工品，或作為其它類物質，具有工藝簡單、低能耗、無污染等許多常規處理技術難以比擬的優點。因此，微生物轉化技術處理煤炭已成為了國內外研究的熱點。利用白腐真菌，放線菌等進行低階煤液化降解的報道、研究較多，但是利用哈茨木霉特別基因過表達哈茨木霉菌株進行低階煤降解的研究還未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種改良ATMT構建基因過表達哈茨木霉菌在褐煤降解中的應用。通過改良后的ATMT介導的遺傳轉化方法，構建基因過表達哈茨木霉AH菌株，獲得的過表達菌株具有高表達相應基因蛋白的特性，能夠提高菌株降解褐煤的能力。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

S1、將含有重組質粒的農桿菌接種到含有12.5g/ml利福平、100g/ml羧芐青霉素、50g/ml卡那霉素的LB固體培養基上，28 ^oC活化培養。將AH菌接種到產孢培養基中，28 ^oC、180rpm光照培養至開始產孢；AH菌開始產孢子后，將活化好的農桿菌，挑取單菌落接種到2×LB培養基中，28 ^oC、180 rpm 培養1 d；

S2、4500 rpm離心收集農桿菌菌體，利用IM培養基懸浮含有重組質粒的農桿菌菌體，利用IM培養基調節OD600至0.35-0.4之間，28^oC 180rpm培養6h；

S3、6h后取等體積AGL-1菌液與哈茨木霉AH菌IM培養基孢子懸液，構成混液，均勻涂布在表面鋪有硝酸纖維膜的CM培養基上，于28 ^oC避光共培養48h～60h；

S4、待菌絲鋪滿硝酸纖維膜表面時，將硝酸纖維膜轉移至所述SM培養基，28 ^oC避光培養3d，待長出較小轉化子即可；