[發(fā)明專利]改良ATMT構(gòu)建基因過表達哈茨木霉菌株在褐煤降解中的應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2020-08-05
• 公開（公告）號: CN111944839A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姚菁華;肖雷;晏崇偉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國礦業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;C10G1/00;C12R1/885
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種改良ATMT構(gòu)建基因過表達哈茨木霉菌株在褐煤降解中的應(yīng)用，其特征在于，所述ATMT轉(zhuǎn)化方法采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有50mM MES和200μM AS的CM培養(yǎng)基；農(nóng)桿菌與哈茨木霉菌AH共培養(yǎng)時間為48h～60h，真菌菌絲肉眼可見即可；轉(zhuǎn)化子選擇培養(yǎng)基為添加了100μg/mL潮霉素、300μ g/mL Cefotaxime和50μg/mL Moxalactam的PDA固體培養(yǎng)基（SM培養(yǎng)基）；

所用CM培養(yǎng)基：2.05 g/L K₂HPO₄，1.45 g/L KH₂PO₄，0.15 g/L NaCl，0.5 g/L MgSO₄，0.1 g/L CaCl₂，0.0025 g/L FeSO₄，0.5 g/L (NH₄)₂SO₄，2 g/L葡萄糖，5ml/L甘油，20 g/L瓊脂粉；

不加瓊脂時為IM培養(yǎng)基。

2.所述轉(zhuǎn)化方法包括如下步驟：

A1、利用IM培養(yǎng)基懸浮處于對數(shù)生長期的含有重組質(zhì)粒的AGL-1農(nóng)桿菌菌體，利用IM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)OD600至0.35-0.4之間，28^oC 180rpm培養(yǎng)6h；

A2、6h后取等體積AGL-1菌液與哈茨木霉AH菌IM培養(yǎng)基孢子懸液，構(gòu)成混液，均勻涂布在表面鋪有硝酸纖維膜的CM培養(yǎng)基上，于28 ^oC避光共培養(yǎng)48h～60h；

A3、待菌絲鋪滿硝酸纖維膜表面時，將硝酸纖維膜轉(zhuǎn)移至所述SM培養(yǎng)基，28 ^oC避光培養(yǎng)3d，待長出較小轉(zhuǎn)化子即可；

A4、挑選可能的轉(zhuǎn)化子到含有100μg/mL潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，驗證后進行單孢分離，之后接種到不含任何抗生素的PDA平板上連續(xù)傳5代培養(yǎng)，再用含100μg/mL潮霉素的PDA培養(yǎng)基驗證，最后經(jīng)PCR驗證得到陽性轉(zhuǎn)化子。

3.所述pkd7-HYG原始質(zhì)粒含有ATMT轉(zhuǎn)化質(zhì)粒左右兩邊界，以左邊界開始到右邊界結(jié)束其中依次包含獨特的酶切位點：Xho I、Spe I、Bam HI、Sma I、Xba I，trpC啟動子，潮霉素抗性基因的開放閱讀框HYG，TrpC終止子，組蛋白啟動子，RFP基因，組蛋白終止子；

其中RFP基因前后含有獨特的Bam HI 、Sma I 和Xba I酶切位點，能夠通過酶切將RFP完整去掉進而替換成所需要表達的基因。

4.原始pkd7-HYG質(zhì)粒全部長度共11048bp。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述改良ATMT構(gòu)建基因過表達哈茨木霉菌株在褐煤降解中的應(yīng)用其特征在于，所述轉(zhuǎn)化方法中共培養(yǎng)時所用哈茨木霉菌孢子懸液濃度為2×10⁶個/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述，利用所述方法得到的基因過表達菌株在褐煤降解中的應(yīng)用。