[發(fā)明專利]一種間充質(zhì)干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010774698.8
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111808808A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹毓琳;滕睿頔;張海林
• 申請（專利權(quán)）人: 北京臻溪谷醫(yī)學研究中心（有限合伙）
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071;A61L27/60;A61L27/38;A61L27/36
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松;宋丹丹

本發(fā)明提供了一種間充質(zhì)干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，該培養(yǎng)方法包括以下步驟：S1：間充質(zhì)干細胞懸液的制備：將間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)至細胞90％匯合時，收集P3代細胞，制成間充質(zhì)干細胞懸液；S2：附著：將脫細胞異體真皮支架與間充質(zhì)干細胞懸液放置于超低吸附反應(yīng)皿中使用完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，先在37℃條件下震蕩培養(yǎng)，再靜置培養(yǎng)2?3天，培養(yǎng)條件如下：溫度為37.0±0.5℃、CO2濃度為5.0±0.2％，濕度為飽和濕度；本發(fā)明的方法制備的人工皮膚進一步減少創(chuàng)面的深度，提供相對滿意的愈合效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物組織器官修復技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種間充質(zhì)干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

正常的皮膚分為三層，角質(zhì)層、真皮層和皮下組織層，真皮層含有豐富的神經(jīng)和血管等，成年哺乳動物的真皮不能自發(fā)地再生，在缺少移植存活的真皮基質(zhì)時，成纖維細胞便開始合成不成熟的基質(zhì)，基質(zhì)經(jīng)重塑形成疤痕，部分疤痕收縮皮膚引起疼痛，部分還會影響相近關(guān)節(jié)活動，對患者的身心健康都有長期影響；市面上已有的脫細胞真皮基質(zhì)是異體真皮經(jīng)特殊處理，去除其細胞成分后得到的一種真皮替代品，異體移植最大的問題就是排異反應(yīng)，而移植皮膚造成排異反應(yīng)的主要是表皮細胞、真皮中的成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等細胞成分；而非細胞成分的細胞外基質(zhì)蛋白和膠原(即脫細胞真皮)則無任何免疫活動，可永久地存在異體宿主體內(nèi)，有效地改善瘢痕形成的皮膚收縮的情況。

慢性創(chuàng)面的原因有很多，除了感染及常見的系統(tǒng)性疾病(如糖尿病)，大面積皮膚缺損也是慢性難愈性創(chuàng)面的主要原因，慢性創(chuàng)面治療時間長，除了給患者造成了軀體及經(jīng)濟上的負擔之外，還嚴重影響到了患者的社會心理健康，因此慢性創(chuàng)面是整形外科乃至整個醫(yī)學界的難題；目前臨床上的常用的修復方法，需要對供區(qū)造成損傷，若受區(qū)損傷面積較大，則供區(qū)可能面臨較大損傷和再次出現(xiàn)愈合不良的風險，近些年來，促進慢性創(chuàng)面的研究有了一定的突破，其中干細胞為解決這一難題提供了新的思路。

脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是一種來源于中胚層的MSCs，可跨胚層多向分化，同時具有自分泌及旁分泌功能，可以分泌多種細胞因子，減輕炎癥反應(yīng)，促進血管新生，與胚胎干細胞和BMSCs不同，ADSCs的獲取途徑廣泛，且可通過局麻微創(chuàng)等方式獲取，不涉及倫理問題；因此已經(jīng)有研究表明ADSCs可以顯著促進創(chuàng)面愈合，研究證實，ADSCs還有抗炎和抗纖維化作用，臨床研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可顯著提高難愈性皮膚潰瘍、放射性皮炎、術(shù)后皮膚壞死等疾病的治療效果；但是傳統(tǒng)的細胞治療方法是將ADSCs直接注射至創(chuàng)面組織，但是效果很難達到患者的需求，其可能的原因是由于創(chuàng)面組織處于慢性炎癥狀態(tài)，注射的ADSCs細胞受局部環(huán)境影響較大，存活率有限，從而很難發(fā)揮促進創(chuàng)面愈合的效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種間充質(zhì)干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種間充質(zhì)干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)方法具體包括以下步驟：

S1：間充質(zhì)干細胞懸液的制備：將間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)至細胞70-90％匯合時，收集P3代細胞，制成間充質(zhì)干細胞懸液；

S2：附著：將脫細胞異體真皮支架與間充質(zhì)干細胞懸液放置于超低吸附反應(yīng)皿中使用完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，先在37℃條件下震蕩培養(yǎng)，再靜置培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)條件如下：溫度為37.0±0.5℃、CO2濃度為5.0±0.2％，濕度為飽和濕度。

進一步地，該培養(yǎng)方法具體包括以下步驟：