[發明專利]一種間充質干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養方法及其應用

在審

• 申請號: 202010774698.8
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111808808A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 曹毓琳;滕睿頔;張海林
• 申請（專利權）人: 北京臻溪谷醫學研究中心（有限合伙）
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/071;A61L27/60;A61L27/38;A61L27/36
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松;宋丹丹

1.一種間充質干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養方法，其特征在于，所述培養方法具體包括以下步驟：

S1：間充質干細胞懸液的制備：將間充質干細胞傳代培養至細胞70-90％匯合時，收集P3代細胞，制成間充質干細胞懸液；

S2：附著：將脫細胞異體真皮支架與間充質干細胞懸液放置于超低吸附反應皿中使用完全培養基進行培養，先在37℃條件下震蕩培養，再靜置培養2-3天，培養條件如下：溫度為37.0±0.5℃、CO2濃度為5.0±0.2％，濕度為飽和濕度。

2.如權利要求1所述的間充質干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養方法，其特征在于，所述培養方法具體包括以下步驟：

S1：間充質干細胞懸液的制備：將間充質干細胞傳代培養，用完全培養基培養至細胞70-90％匯合時，收集P3代細胞，制成間充質干細胞懸液；所述完全培養基為：以DMEM/F12為基礎培養基，添加濃度為20-30μg/ml的人纖連蛋白、濃度為5-15ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、濃度為10-20ng/ml的人表皮細胞生長因子、濃度為0.5-1.5％的ITS、濃度為4-6％的人血白蛋白、濃度為0.5-1.5％的NEAA、濃度為0.05-0.15μmol/L的氫化考的松、濃度為0.05-0.15％的β-巰基乙醇；

S2：附著：將脫細胞異體真皮支架與間充質干細胞懸液放置于超低吸附反應皿中使用完全培養基進行培養，先在37℃條件下震蕩培養20-40min，搖床轉速為40-60r/min，后停止震蕩，靜置繼續培養3-6天，培養條件如下：溫度為37.0±0.5℃、CO2濃度為5.0±0.2％，濕度為飽和濕度。

3.如權利要求1所述的間充質干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養方法，其特征在于，所述培養方法具體包括以下步驟：

S1：間充質干細胞懸液的制備：將間充質干細胞傳代培養，用完全培養基培養至細胞90％匯合時，收集P3代細胞，制成間充質干細胞懸液；所述完全培養基為：以DMEM/F12為基礎培養基，添加濃度為20μg/ml的人纖連蛋白、濃度為5ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、濃度為10ng/ml的人表皮細胞生長因子、濃度為0.5的ITS、濃度為4％的人血白蛋白、濃度為0.5％的NEAA、濃度為0.05μmol/L的氫化考的松、濃度為0.05％的β-巰基乙醇；

S2：附著：將脫細胞異體真皮支架與間充質干細胞懸液放置于超低吸附反應皿中使用完全培養基進行培養，先在37℃條件下震蕩培養20min，搖床轉速為40r/min，后停止震蕩，靜置繼續培養3天，培養條件如下：溫度為37.0±0.5℃、CO₂濃度為5.0±0.2％，濕度為飽和濕度。

4.如權利要求1-3任一所述的間充質干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養方法，其特征在于，所述間充質干細胞包括脂肪間充質干細胞、臍帶間充質干細胞和宮內膜間充質干細胞中的一種。

5.如權利要求4所述的間充質干細胞在脫細胞異體真皮支架上的培養方法，其特征在于，所述間充質干細胞為脂肪間充質干細胞，所述脂肪間充質干細胞懸液的制備方法如下：

(1)取脂肪細胞；

(2)將所述脂肪細胞放置于試管內，在試管中加入與脂肪組織量相同體積的消化液，所述消化液包括體積比為1:1的胰蛋白酶-EDTA和0.1％的I型膠原酶，將試管密封，放入37℃的恒溫搖床中以180-200r/Min的速度震蕩消化，分為3層；

(3)吸出離心管中的下層液體移入裝有完全培養基的新離心管中終止消化，將離心管封閉，離心，分為2層；

(4)用吸管吸取新離心管中的上清后去掉，加入完全培養基，輕輕吹打制成細胞懸液；

(5)將細胞懸液按照0.5×10⁶/ml的密度接種到培養瓶中，放入37℃、5％CO₂培養箱培養；12-24小時后進行第一次換液，此后每隔3天換液，待細胞生長至融合后進行傳代；

(6)吸去培養瓶內的舊培養基，加PBS沖洗2-3次，再加入消化液消化3-5min，所述消化液為胰蛋白酶-EDTA；輕輕吹打細胞，使細胞脫離瓶底得到單細胞懸液。