[發明專利]一種檢測雞傳染性喉氣管炎病毒RPA擴增方法

在審

• 申請號: 202010774196.5
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111910019A
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 叢鋒;蔡蔚游;李根;曾偉偉;朱余軍
• 申請（專利權）人: 廣東省實驗動物監測所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 廣州本諾知識產權代理事務所(普通合伙) 44574
• 代理人: 朱彩霞

本發明公開了一種檢測雞傳染性喉氣管炎病毒RPA擴增方法，包括以下步驟，S1：病毒核酸的提取，S2:目的基因的克隆，S3：RPA引物和探針的設計，S4：RPA方法的建立，S5：特異性試驗與靈敏度試驗,S6：臨床樣品的檢測。本發明利用重組酶蛋白與引物形成復合物；該復合物促進引物與雙鏈DNA的同源靶序列的結合，聚合酶進行后續的合成，整個過程僅需在37?42℃下反應20?30分鐘即可，與普通PCR方法與熒光定量PCR方法相比，整個過程不需要高溫變性和低溫退火步驟，操作簡單，不需要昂貴的儀器。

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，尤其涉及一種檢測雞傳染性喉氣管炎病毒RPA擴增方法。

背景技術

雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)能引起雞的一種呼吸道的傳染病，具有高度接觸性和急性感染的特征，該病被稱為雞傳染性喉氣管炎。急性感染的雞群可出現高的發病率和死亡率，慢性感染可引起結膜炎、產蛋和蛋品質下降，從1925年首次報道本病以來，已在全球各地流行，近些年來，在我國多地也呈流行趨勢，給養雞業造成的損失不容忽視。一個快速方便的檢測方法對該疾病的控制是非常重要的。

傳統的檢測ILTV的方法有病毒分離和血清學鑒定方法，但這些方法都費時費力。隨著分子生物學的快速發展，一些依據核酸擴增的分子學方法也在實驗室建立了，例如，普通PCR，熒光定量PCR，環介導等溫擴增方法(LAMP)，液相基因芯片，GeXP多重PCR等，PCR跟熒光量PCR由于他們的特異性和靈敏度，用于實驗室常規的檢測方法，液相基因芯片和GeXP多重PCR由于他們的高通量，用于臨床樣品的篩查，但這些方法都需要復雜和貴的儀器，所以不適用于養殖場。LAMP方法是一種等溫擴增利用4-6條引物的方法，但引物設計麻煩且假陽性率高。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是近年來發展起來的一種快速診斷不同病原的方法，已廣泛用于病毒、細菌、寄生蟲診斷中。RPA利用重組酶蛋白與引物形成復合物；該復合物促進引物與雙鏈DNA的同源靶序列的結合，聚合酶進行后續的合成，整個過程僅需在37-42℃下反應20-30分鐘即可。與普通PCR方法與熒光定量PCR方法相比，整個過程不需要高溫變性和低溫退火步驟，操作簡單，不需要昂貴的儀器。RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達到30-35個堿基，擴增產物在300bp以內。本研究針對傳染性喉氣管炎病毒的5’端序列，建立了實時熒光RPA檢測方法，為ILTV快速診斷及防控提供了技術參考。

發明內容

基于背景技術存在的技術問題，本發明提出了一種檢測雞傳染性喉氣管炎病毒RPA擴增方法。

本發明提出的一種檢測雞傳染性喉氣管炎病毒RPA擴增方法，包括以下步驟：

S1：病毒核酸的提取，使用DNA提取試劑盒對ILTV進行DNA提取，將200μL病毒溶液加入1.5mL離心管中，加入20μL蛋白酶K和200μL載體RNA溶液，搖動混合物并混合，在56℃水浴15分鐘后，加入250μL無水乙醇，轉移到管中，并以8000轉/分鐘離心1分鐘，將洗滌溶液洗滌兩次，然后加入TE，在室溫下放置5分鐘并離心以獲得病毒DNA；

S2:目的基因的克隆，使用PCR方法擴增目的基因，擴增體系為：95℃/15min預變性，94℃/30Sec，55℃/30Sec和72℃/90Sec 35個循環，72℃延伸10分鐘，通過瓊脂糖凝膠電泳回收PCR目的產物；

將4.5μL回收產物與0.5μL pMD-18T vector、5μL solution I總體積共10μL混勻，放4℃連接過夜克隆到pMD-18T載體中，構建質粒；