[發明專利]一種檢測雞傳染性喉氣管炎病毒RPA擴增方法

在審

• 申請號: 202010774196.5
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111910019A
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 叢鋒;蔡蔚游;李根;曾偉偉;朱余軍
• 申請（專利權）人: 廣東省實驗動物監測所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 廣州本諾知識產權代理事務所(普通合伙) 44574
• 代理人: 朱彩霞

1.一種檢測雞傳染性喉氣管炎病毒RPA擴增方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：病毒核酸的提取，使用DNA提取試劑盒對ILTV進行DNA提取，將200μL病毒溶液加入1.5mL離心管中，加入20μL蛋白酶K和200μL載體RNA溶液，搖動混合物并混合，在56℃水浴15分鐘后，加入250μL無水乙醇，轉移到管中，并以8000轉/分鐘離心1分鐘，將洗滌溶液洗滌兩次，然后加入TE，在室溫下放置5分鐘并離心以獲得病毒DNA；

S2:目的基因的克隆，使用PCR方法擴增目的基因，擴增體系為：95℃/15min預變性，94℃/30Sec，55℃/30Sec和72℃/90Sec 35個循環，72℃延伸10分鐘，通過瓊脂糖凝膠電泳回收PCR目的產物；

將4.5μL回收產物與0.5μL pMD-18T vector、5μL solution I總體積共10μL混勻，放4℃連接過夜克隆到pMD-18T載體中，構建質粒；

將10μL連接產物轉化DH5a大腸桿菌感受態細胞中，將10μL連接產物加入100μL感受態細胞中輕輕混勻，冰浴30min，金屬浴42℃熱激90Sec后冰浴5min，加入1mL LB培養基后在200rpm，37℃的搖床上搖1h；涂布含有氨芐抗性的平板，挑取陽性菌落擴大培養；

S3：RPA引物和探針的設計，從NCBI下載ILTV全基因序列，設計ILTV特異性RPA探針，再根據該探針設計了4對引物，篩選最佳的引物對，設計引物的長度范圍為30至35個堿基，探針長度范圍為48至52個堿基，RPA探針應該有四個基團，包括熒光基團，猝滅基團，四氫呋喃和3端封閉，所有引物和探針均在設計完成后進行合成提取；

S4：RPA方法的建立，使用試劑盒以50uL體積進行RPA反應，包括420nM正向引物，420nM反向引物，120nM外探針，1uL病毒DNA和280mM鎂離子，RPA反應在39℃下在實時恒溫熒光檢測器中擴增30分鐘；

S5：特異性試驗與靈敏度試驗,對于靈敏度分析，實時RPA使用質粒稀釋的標準品，用easy dilution以10倍的比例稀釋至7個濃度，模板為1×106copies/μL至1×100copies/μL，通過測試含有陽性核酸的ILTV以及來自其他病原體的其他核酸，包括馬立克病毒、新城疫病毒、禽貧血病毒、傳染性法氏囊病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒、禽白血病病毒、禽呼腸孤病毒來確定構建的實時RPA方法的特異性。

S6：臨床樣品的檢測，用所構建的RPA檢測方法對115個實驗室保存臨床樣本進行測試。

2.根據權利要求1所述的一種檢測雞傳染性喉氣管炎病毒RPA擴增方法，其特征在于，所述S3中RPA引物和探針如下：