[發明專利]一株具有XR-XDH途徑的可快速發酵木糖的釀酒酵母菌株及構建方法

在審

• 申請號: 202010773739.1
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN112011472A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 湯岳琴;繆晡;謝采云;陳棟
• 申請（專利權）人: 中國石油化工股份有限公司;中石化上海工程有限公司;四川大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N1/36;C12N15/53;C12N15/65;C12N15/66;C12N15/81;C12N15/04;C12R1/865
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郎祺

本發明提供了一株具有XR?XDH途徑的可快速發酵木糖的釀酒酵母菌株及構建方法，該釀酒酵母菌株為SEB13，分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏編號為CGMCC No.19586。本發明以發酵性能優良的工業釀酒酵母菌株作為出發菌株，結合基因定點突變、基因工程、交配和進化工程手段構建了一株具有XR?XDH途徑的木糖發酵性能優良且具有優良抑制物耐受的酵母菌株SEB13，該菌株具有較高的木糖消耗速率和乙醇生成速率，為秸稈燃料乙醇工業化生產提供了優良菌株來源，具有很好的工業應用潛力。

技術領域

本發明涉及微生物重組技術領域，尤其涉及一株具有XR-XDH途徑的可快速發酵木糖的釀酒酵母菌株及構建方法。

背景技術

生物液體燃料生物乙醇被認為是一種可替代化石燃料汽油的清潔能源，基于我國發展燃料乙醇需遵循“不與人爭糧，不與糧爭地”的原則，含有大量可發酵糖的秸稈等廢棄生物質將成為燃料乙醇生產的主要原料。秸稈水解液含有以葡萄糖和木糖為代表的六碳糖和五碳糖，將它們發酵轉化成乙醇，實現全糖利用，是進行秸稈燃料乙醇生產的基礎。同時，由于秸稈原料預處理和水解過程中會產生多種副產物如小分子有機酸、呋喃醛類、酚醛類物質，它們會顯著抑制乙醇發酵微生物的生長和發酵，因此構建具有抑制物耐受力且能同時發酵葡萄糖和木糖的可工業化應用的微生物菌株對于秸稈原料的燃料乙醇生產至關重要。

釀酒酵母作為傳統的乙醇工業生產微生物，具有魯棒性且乙醇產率高，但是它不能利用木糖。在釀酒酵母中異源表達樹干畢赤酵母的木糖代謝XR-XDH(木糖還原酶-木糖醇脫氫酶)途徑，同時高表達釀酒酵母內源XK(木酮糖激酶)，能夠賦予釀酒酵母代謝木糖的能力。但由于XR偏好NADPH而XDH只利用NAD⁺作為輔酶導致該途徑輔酶不平衡，中間代謝產物木糖醇大量積累，乙醇收率偏低。因此如何降低該途徑木糖醇的積累同步提升木糖代謝速率以及乙醇收率是獲得優秀木糖發酵菌株的關鍵。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供一株具有XR-XDH途徑的可快速發酵木糖的釀酒酵母菌株及構建方法，以發酵性能優良的工業釀酒酵母菌株作為出發菌株，結合基因定點突變、基因工程、交配和進化工程手段構建了一株具有XR-XDH途徑的木糖發酵性能優良且具有優良抑制物耐受的酵母菌株，為秸稈燃料乙醇工業化生產提供了優良菌株來源。

本發明為解決上述技術問題采用以下技術方案：

本發明的第一方面是提供一株具有XR-XDH途徑的可快速發酵木糖的釀酒酵母菌株，其為SEB13，分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏編號為CGMCCNo.19586，保藏日期為2020年04月20日，保藏單位為中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

本發明的第二方面是提供上述具有XR-XDH途徑的可快速發酵木糖的釀酒酵母菌株的構建方法，包括如下步驟：

步驟一，含雙位點突變XYL1基因(編碼XR)和KanMX基因的質粒pKX1(D)X2XK的構建：

(1)以pXR作為模板，用第一引物對擴增得到雙堿基突變的XYL1片段1，用第二引物對擴增得到雙堿基突變的XYL1片段2；用XYL1片段1和XYL1片段2為模板，用第三引物對進行融合PCR，得到雙突變XYL1片段；

(2)將上述XYL1雙突變片段與pKX1X2XKS同時進行雙酶切，純化后連接得到pBX1(D)X2XK質粒；

(3)以質粒pKX1X2XKS為模板，采用第三引物對擴增出KanMX片段；將此KanMX片段和pBX1(D)X2XK質粒同時酶切、連接，篩選并測序得到質粒pKX1(D)X2XK；

步驟二，木糖代謝單倍體菌株的構建：