[發明專利]一株具有XR-XDH途徑的可快速發酵木糖的釀酒酵母菌株及構建方法

在審

• 申請號: 202010773739.1
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN112011472A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 湯岳琴;繆晡;謝采云;陳棟
• 申請（專利權）人: 中國石油化工股份有限公司;中石化上海工程有限公司;四川大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N1/36;C12N15/53;C12N15/65;C12N15/66;C12N15/81;C12N15/04;C12R1/865
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郎祺

1.一株具有XR-XDH途徑的可快速發酵木糖的釀酒酵母菌株，其特征在于，為SEB13，分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏編號為CGMCC No.19586，保藏日期為2020年04月20日，保藏單位為中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

2.一種如權利要求1所述釀酒酵母菌株的構建方法，包括如下步驟：

步驟一，含雙位點突變XYL1基因和KanMX基因的質粒pKX1(D)X2XK的構建：

(1)以pXR作為模板，用第一引物對擴增得到雙堿基突變的XYL1片段1，用第二引物對擴增得到雙堿基突變的XYL1片段2；用所述XYL1片段1和XYL1片段2為模板，用第三引物對進行融合PCR，得到雙突變XYL1片段；

(2)將所述XYL1雙突變片段與pKX1X2XKS同時進行雙酶切，純化后連接得到質粒pBX1(D)X2XK；

(3)以質粒pKX1X2XKS為模板，采用第三引物對擴增出KanMX片段；將此KanMX片段和所述質粒pBX1(D)X2XK同時酶切、連接，篩選并測序得到質粒pKX1(D)X2XK；

步驟二，木糖代謝單倍體菌株的構建：

(1)以所述質粒pKX1(D)X2XK為模板擴增出片段XYL1(D)-XYL2-XKS1；

(2)將所述XYL1(D)-XYL2-XKS1轉化到單倍體菌株KFG4-6B，得到XR雙突變重組菌株，命名為HX57D；

步驟三，單倍體菌株交配和二倍體菌株混合菌株進化工程：

(1)取等量的所述HX57D與KFG5-5C新鮮酵母細胞，混合均勻、接種到培養基中，培養；

(2)培養完成，確定為二倍體后，然后以木糖為唯一碳源進行馴化；

步驟四，取馴化過程中保存的菌液進行突變菌株分離和篩選，得到上述具有XR-XDH途徑的可快速發酵木糖的釀酒酵母菌株。

3.根據權利要求2所述的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，步驟一中所述第一引物對的序列為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；所述第二引物對的序列為SEQ ID No.3和SEQID No.4；所述第三引物對的序列為SEQ ID No.1和SEQ ID No.3。

4.根據權利要求2所述的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，步驟一(2)中所述XYL1雙突變片段與pKX1X2XKS同時進行Apa I、Xho I雙酶切。

5.根據權利要求2所述的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，步驟一(3)中所述KanMX片段和pBX1(D)X2XK質粒同時用Apa I酶切。

6.根據權利要求2所述的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，步驟二(1)中所述擴增所采用的引物序列為SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。

7.根據權利要求2所述的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，步驟二(2)中所述轉化采用方法為醋酸鋰法。

8.根據權利要求2所述的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，在馴化之前，將待馴化菌株在2％YPD平板上過夜活化，取適量菌體接種到含100mL 5％YPD的500mL三角瓶中，在恒溫搖床中以30℃、160r/min條件預培養16h；然后9,000g離心1min收集菌體。

9.根據權利要求8所述的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，所述馴化包括如下階段：

第一階段，將所述菌體以接種量OD660＝0.1接種到含2％YNBX的培養基中，每24小時轉接一次；

第二階段，將第一階段得到的菌液以接種量OD660＝0.01接種到2％YNBX培養基，每48h或24h傳代一次；

第三階段，將第二階段得到的菌液以接種量OD660＝0.01接種到4％YNBX，每24h傳代一次，直至監測數據在連續5次轉接中沒有明顯變化，停止轉接，保存菌液。

10.根據權利要求9所述的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，所述馴化的條件為35℃、200r/min。