[發(fā)明專利]一種尿苷磷酸酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010772689.5
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111748537B
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范文超;王金剛;梁巖;高書良;袁圣倫;任亮
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江華睿生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N1/21;C12P19/38;C12P19/30;C12R1/19
• 代理公司: 上海申浩律師事務(wù)所 31280
• 代理人: 賈師英

本發(fā)明公開了一種尿苷磷酸酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3，能夠有效催化核糖?1?磷酸與煙酰胺反應(yīng)生成煙酰胺核糖，并可與嘌呤核苷磷酸化酶和煙酰胺核糖激酶一起構(gòu)成三酶體系聯(lián)合催化原料鳥苷、磷酸鹽、煙酰胺和ATP反應(yīng)一鍋法合成β?煙酰胺單核苷酸，具有較好的工業(yè)化開發(fā)和應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和酶催化技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種尿苷磷酸酶突變體、及其在合成煙酰胺核糖和β-煙酰胺單核苷酸中的用途。

背景技術(shù)

β-煙酰胺單核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide，簡稱β-NMN或者NMN)廣泛存在于自然界的生物中，是NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，又叫輔酶I)的直接前體，而NAD是細(xì)胞內(nèi)眾多生化反應(yīng)進(jìn)行的重要輔酶。NMN攝入機(jī)體細(xì)胞后，可在NMNAT酶催化作用下，合成NAD，通過NAD來體現(xiàn)其功能。經(jīng)研究，NMN具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、修復(fù)DNA損傷、增強(qiáng)耐力、解酒護(hù)肝、增強(qiáng)胰島素敏感性、保護(hù)視力和聽力等作用。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的β-NMN的制備方法有三種，包括化學(xué)合成、酶催化法以及微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成方法以煙酰胺和核糖為原料，核糖經(jīng)基團(tuán)保護(hù)獲得四乙酰核糖，然后再與煙酰胺反應(yīng)，再經(jīng)脫保護(hù)獲得煙酰胺核糖(NR)，最后在磷酸化獲得NMN，反應(yīng)體系成分復(fù)雜、分離提取難度大，收率低，生產(chǎn)過程涉及較多的有機(jī)溶劑，如三氟甲磺酸三甲硅酯、甲醇、二氯甲烷等，生產(chǎn)環(huán)保壓力較大。酶催化有兩種方案，一是以NR、ATP(三磷酸腺苷二鈉)為底物，在其激酶的催化下合成NMN；另一種是以核苷、煙酰胺和ATP為底物多酶體系下催化合成NMN，但由于NMN在細(xì)胞內(nèi)容易被降解，因此多采用純酶體系來催化，這導(dǎo)致了較高的生產(chǎn)成本。微生物發(fā)酵法僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道，產(chǎn)量均在毫克每升，還沒有工業(yè)應(yīng)用的價(jià)值。

隨著近年來對NMN功能的深入了解，NMN的需求也呈現(xiàn)快速的增長，但高昂的價(jià)格也限制了其廣泛應(yīng)用，因此開發(fā)高效、低廉的NMN酶法合成工藝成為該產(chǎn)品的關(guān)鍵。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，尿苷磷酸酶可以與嘌呤核苷磷酸化酶和煙酰胺核糖激酶一起構(gòu)成三酶體系聯(lián)合催化原料鳥苷、磷酸鹽、煙酰胺和ATP反應(yīng)一鍋法合成β-煙酰胺單核苷酸，但現(xiàn)有技術(shù)的尿苷磷酸酶的低酶活力成為了酶促合成NMN的制約因素。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服尿苷磷酸酶對煙酰胺底物活性低的問題，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)對大腸桿菌來源的尿苷磷酸酶(又稱尿嘧啶核苷磷酸化酶，Uridine phosphorylase)進(jìn)行改造和篩選，對其煙酰胺底物特異性及催化活力進(jìn)行了改進(jìn)，同時與嘌呤核苷磷酸化酶和煙酰胺核糖激酶共同作用實(shí)現(xiàn)多酶體系聯(lián)合催化一鍋合成NMN。具體來說，本發(fā)明包括如下技術(shù)方案：

一種尿苷磷酸酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3：

MSKSDVFHLGLTKNDLQGATLAIVPGDPDRVEKIAALMDKPVKLASHREFTTWRAELDGKPVIVCSTGIGGPSTSIAVEELAQLGIRTFLRIGTTGAIQPHINVGDVLVTTASVRLDGASLHFAPLEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTGYPGQERYDTYSGRVVRHFKGSMEEWQAMGVMNAEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVGSNRTQQEIPNAETMKQTESHAVKIVVEAARRLL(SEQ ID NO:3)。

其為大腸桿菌Escherichia coli K-12來源的尿苷磷酸酶SEQ ID NO:1(GenBank序列號為P12758)第162位的F替換為G、第195位的Y替換為A、第220位的I替換為G的突變體、第221位的V替換為S的突變體。

本發(fā)明的第二個方面在于提供編碼上述尿苷磷酸酶突變體的基因。

優(yōu)選地，編碼上述尿苷磷酸酶突變體SEQ ID NO:3的基因可以是下述核苷酸序列SEQ ID NO:4：