[發明專利]一種高通量的基因編輯方法

有效

• 申請號: 202010772166.0
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111979258B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 謝卡斌;陳凱園
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/64;C12N15/113
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 董大媛

本發明提供了一種高通量基因的編輯方法，屬于基因工程技術領域；將標簽序列1～11分別插入到pRGEB32載體的T?DNA中，得到高通量基因敲除載體p32A1～p32A11；將tRNA和ccdB基因插入到pRGEB32以及p32A1～p32A11載體中，得到提高克隆準確率的基因敲除載體p32B0～p32B11。使用本發明提供的高通量基因敲除載體在水稻中進行大規模的基因敲除時，能夠快速獲得特定基因編輯的轉基因株系，無需測序，僅通過PCR和PAGE的方法即可確定轉基因株系的靶基因，大大縮減工作量和工作時間，靶位點編輯的效率達92.5％，雙等位基因突變效率達82.1％。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種高通量的基因編輯方法。

背景技術

隨著測序技術的快速發展，從低等微生物到高等動植物，越來越多的物種完成了全基因的測序，如何系統地解析基因組上各個基因位點在不同生物學過程中的功能則是生命科學研究更大的挑戰。

通過敲除目標基因，使其喪失功能，是目前研究特定基因功能最為常用的方法之一。近幾年，CRISPR/Cas9基因組編輯技術出現，為分子生物學的研究提供了強大的技術支持。CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats–CRISPR associated nuclease)系統是存在于細菌和古細菌中的一種適應性免疫機制，能夠特異地識別并降解入侵的噬菌體和外源質粒的DNA。其中來自于化膿鏈球菌Streptococcus pyogenes的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統，被成功應用于許多物種的基因組編輯。CRISPR/Cas9基因組編輯系統由一條單鏈向導RNA-sgRNA和核酸酶Cas9蛋白兩部分組成，sgRNA引導著Cas9蛋白識別并切割基因組特定位點引起靶位點DNA雙鏈斷裂，接著利用細胞內源DNA修復系統對DSB修復時，可能產生插入、缺失以及替換等情況，從而造成目標基因移碼突變，實現基因敲除的目的。

由于CRISPR/Cas9對靶位點識別的特異性依賴于向導RNA中與靶位點互補配對的20個左右的堿基序列，對于不同位點的編輯，僅需替換載體上20bp的核苷酸序列，因此CRISPR系統更適宜于高通量大規模的突變體庫的構建。目前已有一些研究報道，利用CRISPR/Cas9系統在哺乳動物細胞以及植物如水稻中建立了全基因規模的突變體庫(Shalem et al.,2014；Wang et al.,2014；Meng et al.,2017；Lu et al.,2017)，這些研究大都采用相似的方法，即首先合成sgRNA寡聚核苷酸文庫，然后連接到載體中構建CRISPR載體文庫，再將CRISPR載體以混合的方式轉入到受體細胞中。但該方法存在著許多需要改進的地方，以水稻突變體庫的構建為例，需要得到足夠的敲除特定基因的植株以確定植物的表型是由于基因功能的變化導致的，而不是由于脫靶或T-DNA的插入位置造成的。而使用常規的混合質粒文庫通過農桿菌介導的遺傳轉化來獲得大量轉基因植株的方法，很難在短時間內得到足夠的敲除某些特定基因的植株。另外，需要大量的測序來確定所有轉基因植株的靶位點信息，耗時耗力花費巨大。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種高通量的基因編輯方法，采用本發明提供的方法在進行大規模的基因敲除時，可以大大縮減工作量和工作時間。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種高通量的基因編輯方法，包括以下步驟：

1)將標簽序列1～11分別插入到pRGEB32載體的T-DNA中，得到p32A1～p32A11載體；

所述標簽序列1～11的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～11所示；

2)將tRNA片段和ccdB片段插入到步驟1)得到的pRGEB32載體和p32A1～p32A11載體中，得到基因敲除載體p32B0～p32B11；