[發明專利]一種高通量的基因編輯方法有效
| 申請號： | 202010772166.0 | 申請日： | 2020-08-04 |
| 公開（公告）號： | CN111979258B | 公開（公告）日： | 2022-04-19 |
| 發明（設計）人： | 謝卡斌;陳凱園 | 申請（專利權）人： | 華中農業大學 |
| 主分類號： | C12N15/63 | 分類號： | C12N15/63;C12N15/64;C12N15/113 |
| 代理公司： | 北京高沃律師事務所 11569 | 代理人： | 董大媛 |
| 地址： | 430070 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 通量 基因 編輯 方法 | ||
1.一種高通量的基因編輯方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)將標簽序列1～11分別插入到pRGEB32載體的T-DNA中，得到p32A1～p32A11載體；
所述標簽序列1～11的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～11所示；
2)將tRNA片段和ccdB片段插入到步驟1)得到的pRGEB32載體和p32A1～p32A11載體中，得到基因敲除載體p32B0～p32B11；
所述tRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述ccdB片段的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述基因敲除載體p32B0是tRNA片段和ccdB片段插入到pRGEB32載體中得到；
所述基因敲除載體p32B1～p32B11是tRNA片段和ccdB片段依次插入到p32A1～p32A11載體中得到；
3)將所述步驟2)得到的CRISPR系統的基因敲除載體p32B0～p32B11進行高通量基因編輯；
所述步驟2)基因敲除載體的構建方法包括：將所述tRNA片段和ccd B片段進行連接，得到連接片段，將所述連接片段插入到pRGEB32載體和p32A1～p32A11載體中，得到基因敲除載體。
2.根據權利要求1所述的編輯方法，其特征在于，所述連接使用的體系，每50μl包括25μl 2×Hi-Fi MIX、tRNA片段50ng、ccdB片段50ng、濃度為10μM的32B-F12μl、濃度為10μM的32B-R22μl、水補足至50μl。
3.根據權利要求2所述的編輯方法，其特征在于，所述32B-F1的核苷酸序列如SEQ IDNo.14所示，所述32B-R2的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。
4.根據權利要求1或2所述的編輯方法，其特征在于，所述連接的程序為98℃2min；98℃10s，60℃10s，72℃15s/kb，共35個循環。
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