[發明專利]柑橘潰瘍病菌RPA檢測的特異引物、試劑盒和方法

有效

• 申請號: 202010772043.7
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111690759B
• 公開（公告）日: 2023-10-17
• 發明（設計）人: 宋震;周常勇;馬志敏;段玉;許建建;賓羽
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/64
• 代理公司: 重慶雙馬智翔專利代理事務所(普通合伙) 50241
• 代理人: 方洪

本發明公開了一種柑橘潰瘍病菌RPA檢測的特異引物，序列為：上游引物：5’?GTTGGTGTCGTCGCTTGTATGGACTATAGT?3’，下游引物：5’?GCCGCGCACGGGTGCAAAAAATCTTCAACTTC?3’。還公開了含有該特異引物的柑橘潰瘍病菌RPA檢測試劑盒，及一種柑橘潰瘍病菌RPA檢測的方法：1)提取待測樣品基因組DNA；2)利用提取的樣品基因組DNA進行RPA反應，所用特異引物為權利要求1中所述的特異引物；3)RPA反應完成后對反應產物進行檢測，檢測到目標擴增對象的即為陽性樣品。本發明方法具強特異性和高靈敏等特點，不需要PCR儀等熱循環設備，操作簡單。

技術領域

本發明涉及植物病害檢測技術領域，具體涉及一種柑橘潰瘍病菌RPA檢測的特異引物、試劑盒和方法。

背景技術

柑橘是世界也是我國最大的水果產業，柑橘潰瘍病(Citrus canker)是由柑橘黃單胞菌柑橘亞種(Xanthomonas citri ssp.citri，Xcc)引起的一種破壞性極強的檢疫性細菌病害。感染該菌的柑橘葉片、枝條、果實等出現潰瘍病斑癥狀，導致落葉落果、樹勢衰退，嚴重影響柑橘產業發展。近年來，隨著我國晚熟雜柑的迅猛發展，因引種繁殖材料及苗木的不規范，大大加劇了此病的傳播。Xcc一般在柑橘樹枝或葉形成的病斑上越冬，第二年春天在病斑上繁殖后形成初級傳染源，田間多經自然風雨或潛葉蛾等傳播，氣孔、皮孔或傷口是其主要入口，侵染新葉成為新的病斑，形成二次傳染源，再次傳染到新的夏秋梢形成病斑，在新的病斑進行下次越冬，以此形成病害循環。對此病的田間防控，在疫區多采用化防與農業防治措施相結合的綜防措施；在非疫區，應嚴格實施檢驗檢疫，而這些措施的實施往往與潰瘍病的檢測密切相關。

傳統潰瘍病檢測有癥狀目測法、病理組織切片法、病原菌分離培養等，后來又發展了血清學檢測方法，如酶聯免疫吸附法(ELISA)、斑點免疫結合法和A蛋白酶聯法等，這些方法大多需時長，有的需用酶聯檢測儀，其靈敏度也有待提升。本世紀以來，發展了分子檢測方法，如普通PCR、實時PCR以及LAMP等。普通PCR和實時PCR法需要PCR儀，操作實施時均耗時費力，對操作技巧、試驗儀器的要求較高，限制了基層的使用；而LAMP需要復雜的探針設計和較長的反應時間。因此，研究快速簡便的檢測方法對柑橘潰瘍病的檢驗檢疫和繁殖無病苗木具有現實意義。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技術是一種新型恒溫擴增技術，在25-43℃恒溫條件下反應5-20min就可以擴增出檢測產物。該技術具有反應快速、靈敏、特異性高等強等特點，且不需要昂貴的變溫實驗儀器，被認為是一種可以替代PCR的新型核酸擴增技術。RPA技術的關鍵在于引物的設計。目前對于柑橘潰瘍病菌的RPA檢測尚未見報道。

發明內容

本發明的目的是針對上述問題，提供一種柑橘潰瘍病菌RPA檢測的特異引物，所述特異引物的核苷酸序列為：

上游引物：5’-GTTGGTGTCGTCGCTTGTATGGACTATAGT-3’，

下游引物：5’-GCCGCGCACGGGTGCAAAAAATCTTCAACTTC-3’。

本發明的另一方面提供一種柑橘潰瘍病菌RPA檢測試劑盒，含有上述的特異引物。

所述柑橘潰瘍病菌RPA檢測試劑盒，還含有植物總核酸提取試劑盒、RPA擴增反應試劑、陰性對照、陽性對照。

本發明的又一方面提供一種柑橘潰瘍病菌RPA檢測的方法，包括如下步驟：

1)提取待測樣品基因組DNA；

2)利用提取的樣品基因組DNA進行RPA反應，所用特異引物為權利要求1中所述的特異引物；

3)RPA反應完成后對反應產物進行檢測，檢測到目標擴增對象的即為陽性樣品。