[發明專利]一種利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法

有效

• 申請號: 202010771533.5
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111875688B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 李興飛;華欲飛;楊淑暖;陳業明;孔祥珍;張彩猛
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/30;C07K1/14
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一種利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，屬于蛋白質提取技術領域。本發明使用了天然可食性的負電荷多糖作為回收材料，利用負電荷多糖可以優先結合非目標蛋白沉淀，并與目標蛋白發生相分離的技術原理，實現豌豆清蛋白PA1a的分離純化，制備單一的PA1a。從資源回收利用的角度來看，本發明可以實現高附加值利用豌豆分離蛋白副產物，并從中制備高純度的高含硫活性蛋白組分，為后續的研究提供技術支持。本發明可以提高豌豆乳清的綜合利用，PA1a蛋白回收率高，純度高，且本發明對設備要求低，操作簡單快速，無環境污染問題。

技術領域

本發明涉及一種利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，屬于蛋白質提取技術領域。

背景技術

近年來，植物蛋白引起越來越多人的興趣，人們的飲食結構也逐漸向可持續的植物成分轉變。其中，豌豆作為可持續作物，不僅是淀粉產品的良好來源，更是蛋白產品的良好來源。豌豆蛋白作為低致敏性蛋白，沒有轉基因風險且具有較高的營養價值。在歐美國家，豌豆蛋白乳飲料和發酵乳等備受關注，越來越成為牛乳蛋白飲品的重要替代品。在我國，豌豆蛋白不僅利用率低，且對豌豆蛋白的利用多集中在豌豆分離蛋白，造成占豌豆蛋白含量20%-30%的豌豆乳清蛋白浪費。 豌豆乳清蛋白中硫含量高，硫含量可占總豌豆含硫蛋白的三分之二以上，豌豆乳清蛋白的浪費不僅使得含硫蛋白的大量損失，且大量排放也致使環境問題。

豌豆乳清中富含多種2S和7S乳清蛋白組分，主要包括PA2，PA1和植物凝集素，均具有不同的生理活性。PA1是主要的豌豆2S乳清蛋白之一，其含硫氨基酸約占種子中總含硫量的50%，是由PA1a和PA1b組成，其中 PA1a分子量約6 kDa。PA1已經被證實是對多種昆蟲具有毒害作用的昆蟲毒素生物活性肽。目前對PA1a的純化是以John. A. GATEHOUSE提供的方式為主，采用Sephadex G-75和DEAE-纖維素色譜柱洗脫得到。傳統的色譜柱分離雖具有較高的選擇性，但其昂貴的價格和低的分離速度使得PA1a的分離純化具有較高的成本。而多糖/蛋白靜電作用驅動的復凝聚法制備不僅能快速、高效，而且能以低成本大量得到純化的PA1a。

發明內容

本發明的目的是克服上述不足之處，提供一種利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，該方法快速高效，成本低廉。

本發明的技術方案，本發明提供的一種利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，以豌豆蛋白及粉絲廢水加工副產物豌豆乳清為原料，選取一定濃度的不同類型的負電荷多糖溶液作為回收材料，按照一定的物質量比例加入到豌豆乳清中進行選擇性復凝聚；利用負電荷多糖優先結合非目標蛋白沉淀，并與目標蛋白發生相分離的原理，通過控制多糖用量和溶液pH，沉淀去除豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素，獲得含有PA1a的上清液；通過調節pH，超濾離心除殘留多糖及除小分子物質，制備得到單一的PA1a蛋白組分，再經冷凍干燥得到純度較高的單一豌豆清蛋白PA1a產品。

本發明流程圖如圖1所示，具體步驟如下：

（1）豌豆乳清液的預處理：用鹽酸將豌豆乳清液調節pH至4.0-5.0，在4-10℃下靜置24-48h，離心除沉淀，加入堿液調節上清液pH至7.0-8.0，得到預處理的豌豆乳清液，測定蛋白質含量。

（2）負電荷多糖復凝聚沉淀豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素：取固體多糖樣品粉末，配制質量濃度為0.1%-0.6%的多糖溶液；按照蛋白質:多糖質量比10-5:1向步驟（1）制備的豌豆乳清液中添加相應體積的多糖溶液，并用鹽酸調節pH至3.5-4.6，室溫攪拌15-30min，4000-6000 rpm離心10-20 min，去除沉淀，沉淀即為多糖-PA2/植物凝集素的復凝聚沉淀物。收集剩余上清液，即得富集PA1a的粗提純蛋白液。