[發明專利]一種利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法

有效

• 申請號: 202010771533.5
• 申請日: 2020-08-04
• 公開（公告）號: CN111875688B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 李興飛;華欲飛;楊淑暖;陳業明;孔祥珍;張彩猛
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/30;C07K1/14
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

1.一種利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：以豌豆乳清為原料，使用天然可食性的負電荷多糖作為回收材料，進行復配；利用負電荷多糖優先結合非目標蛋白沉淀，并與目標蛋白發生相分離的原理，通過調節復凝聚條件，沉淀豌豆乳清中的非目標蛋白，實現目標蛋白的分離純化，得到豌豆清蛋白PA1a；具體步驟如下：

（1）豌豆乳清液的預處理：用鹽酸將豌豆乳清液調節pH至4.0-5.0，在4-10℃下靜置24-48h；離心除沉淀，加入堿液調節上清液pH至7.0-8.0，得到預處理的豌豆乳清液，測定蛋白質含量；

（2）負電荷多糖復凝聚沉淀豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素：取固體多糖樣品粉末，配制質量濃度為0.1%-0.6%的多糖溶液；按照蛋白質:多糖質量比10-5:1向步驟（1）制備的豌豆乳清液中添加相應體積的多糖溶液，并用鹽酸調節pH至3.5-4.6，室溫攪拌15-30 min，4000-6000rpm離心10-20 min，沉淀即為多糖-PA2/植物凝集素的復凝聚沉淀物，收集上清液，即得富集PA1a的粗提純蛋白液；

（3）純化PA1a清蛋白：將步驟（2）得到的富集PA1a的粗提純蛋白液，調節pH至7.0-8.0，用截留分子量為10-100 kDa的超濾設備進行超濾除去多糖，3500-5000 rpm離心15-30min，重復超濾1-2次，收集透過液，再用截留分子量為1000-3500Da的超濾設備進行超濾濃縮，除去小分子物質，收集截留液，即得純化的PA1a蛋白液；

（4）PA1a蛋白冷凍干燥：將步驟（3）所得PA1a蛋白液，于-30℃冷凍24-48 h，冷凍樣品置于-40~-60℃、5~10 Pa下進行真空冷凍干燥48-72 h，即制備得到PA1a豌豆清蛋白。

2.根據權利要求1所述利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：步驟（1）所述的豌豆乳清液來源于豌豆分離蛋白加工的副產物及豌豆粉絲廢水經沉淀豌豆分離蛋白后的上清液，其蛋白質含量為0.1%-0.6%。

3.根據權利要求1所述利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：步驟（1）中的離心條件為：4000-8000 rpm，15-30min。

4.根據權利要求1所述利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：步驟（2）所述的負電荷多糖具體為硫酸基團多糖和羧基多糖；其相對分子量范圍大于100 kDa。

5.根據權利要求4所述利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：所述硫酸基團多糖為硫酸葡聚糖，卡拉膠κ-，ι-，λ，硫酸軟骨素或巖藻多糖；所述羧基多糖為羧甲基纖維素，海藻酸鈉，黃原膠或果膠。

6.根據權利要求1所述利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：步驟（2）所述的負電荷多糖的質量濃度與所使用的豌豆乳清液中蛋白質量濃度保持一致。

7.根據權利要求1所述利用負電荷多糖純化豌豆清蛋白PA1a的方法，其特征在于：步驟（3）所述的用截留分子量為10-100 kDa的超濾設備進行超濾除去多糖，優先選擇截留分子量高的超濾膜；用截留分子量為1000-3500 Da的超濾設備進行超濾濃縮，除去小分子物質，優先選擇截留分子量低的超濾膜。