[發(fā)明專利]一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010770820.4
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111876385A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王書宗;董新龍;王晶晶;歐陽雪松;李其翔
• 申請（專利權(quán)）人: 中美冠科生物技術(shù)（太倉）有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N15/88;C12N15/90;C12N15/54;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32267
• 代理人: 朱智杰

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用；本發(fā)明首先通過特殊培養(yǎng)方法構(gòu)建永生化小鼠肺癌mLU6054?KRAS?G12D細胞模型；然后在此基礎(chǔ)上，使用CRISPR?Cas9基因編輯方法將LKB1基因敲除或敲低，建立mLU6054?KRAS?G12D?MLKBKO的特異型細胞模型；最后通過Western Blot和Sanger測序法鑒定得到細胞模型，使之成為一個穩(wěn)定可靠的模型，用于KRAS?G12D突變引起的肺癌靶向藥物的臨床前研究和開發(fā)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小鼠肺癌KRAS 突變細胞模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

技術(shù)背景

據(jù)2019年報告顯示，2015年全國惡性腫瘤發(fā)病約392.9萬人，較2014年的380.4萬增加12.5萬，增長率為3.2％。從發(fā)病人數(shù)看，肺癌位居我國惡性腫瘤發(fā)病首位，發(fā)病人數(shù)為78.4萬。

2015年全國惡性腫瘤死亡例數(shù)約為233.8萬例，較2014年的229.6萬4.2萬，增長率為1.8％。肺癌位居我國惡性腫瘤死亡第1位， 2015年我國因肺癌死亡人數(shù)約為63.1萬例，死亡率為45.87/10萬。

肺癌研究表明，50％的非小細胞肺癌的發(fā)生是由于一系列的驅(qū)動基因，包括EGFR，KRAS,ALK,Akt,MEK,PI3K,BRAF等。其中最常見的為EGFR和KRAS突變。過去十年里，疾病驅(qū)動基因包括 EGFR、ALK、ROS-1和BRAF以及靶向藥物研發(fā)的進步，非小細胞肺癌的治療取得了巨大的進展。然而，一個主要驅(qū)動基因仍沒有相應(yīng)的靶向治療藥物，那就是KRAS。KRAS基因已證實在約25％的非小細胞肺癌(NSCLC)中擴增，但仍沒有成功的靶向KRAS藥物臨床應(yīng)用于臨床。

而對EGFR的靶向藥物治療中，KRAS如果突變，也會導致耐藥性。

所以KRAS的突變細胞模型對于藥物研究和開發(fā)具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種構(gòu)建腫瘤細胞模型mLU6054-KRAS-G12D-mLKB1KO工程細胞系的方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)構(gòu)建永生化小鼠肺癌mLU6054-KRAS-G12D細胞模型；

2)使用CRISPR-Cas9基因編輯方法將步驟1中的細胞模型中的 LKB1基因敲除或敲低，建立mLU6054-KRAS-G12D-MLKBKO的特異型細胞模型。

上述一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構(gòu)建方法，所述步驟2 之后還包括步驟3：通過Western Blot和Sanger測序法鑒定得到細胞模型。

上述一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構(gòu)建方法，所述步驟1 具體包括以下詳細步驟：

a)處死小鼠：將mLU6054鼠源肺癌移植瘤塊的荷瘤小鼠脫頸處死，裸鼠浸泡入75％酒精消毒五分鐘，非裸鼠浸泡10分鐘；

b)剝?nèi)『闪觯河醚劭畦囎雍图舻缎⌒膭內(nèi)×觯杆賹⒘鼋M織完全浸泡在帶雙抗的PBS中，并給瘤塊編號，稱重；