[發明專利]一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202010770820.4
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111876385A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 王書宗;董新龍;王晶晶;歐陽雪松;李其翔
• 申請（專利權）人: 中美冠科生物技術（太倉）有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N15/88;C12N15/90;C12N15/54;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙) 32267
• 代理人: 朱智杰

1.一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）構建永生化小鼠肺癌mLU6054-KRAS-G12D細胞模型；

2）使用CRISPR-Cas9基因編輯方法將步驟1中的細胞模型中的LKB1基因敲除或敲低，建立mLU6054-KRAS-G12D-MLKBKO的特異型細胞模型。

2.根據權利要求1中所述的一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構建方法，其特征在于，所述步驟2之后還包括步驟3：通過Western Blot和Sanger測序法鑒定得到細胞模型。

3.根據權利要求1所述的一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構建方法，其特征在于，所述步驟1具體包括以下詳細步驟：

a）處死小鼠：將mLU6054鼠源肺癌移植瘤塊的荷瘤小鼠脫頸處死，裸鼠浸泡入75%酒精消毒五分鐘，非裸鼠浸泡10分鐘；

b）剝取荷瘤：用眼科鑷子和剪刀小心剝取瘤，迅速將瘤組織完全浸泡在帶雙抗的PBS中，并給瘤塊編號，稱重；

c) 處理荷瘤：在6孔板中每孔加入2mL PBS，清洗并盡量剔去筋膜，棄去膿液、壞死及鈣化組織，最后移至1.5mL滅菌離心管用剪刀剪碎成1mm3;將瘤塊全部移至新的50mL離心管，加入10mL含膠原酶B（2.5mg/ mL）和DNaseⅠ（1X）的消化液， 37℃搖床50 rpm消化1h，使瘤塊充分消化,將消化充分的瘤塊和懸液移至70μm篩網上，濾入新的50mL 離心管，PBS沖洗篩網并補至50mL，1500rpm常溫離心10min;紅細胞較多時需裂紅：移去上清，加入5-10mL ACKlysing buffer，常溫裂解3-5min后，PBS補至50mL，1500rpm 常溫離心5min;棄上清，加入50mL PBS ，1500rpm 常溫離心5min，清洗細胞沉淀1次；

d)重懸荷瘤細胞并傳代培養： 用5-10mL完全培養基重懸腫瘤細胞，并轉移至細胞培養瓶進行培養，每隔3天換液，匯合度達到80-100%時進行傳代，傳至P10。

4.根據權利要求3所述的一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構建方法，其特征在于，所述步驟d的傳代培養具體包括以下步驟：

每次傳代記錄代次，并凍存P0、P1、P2、P10細胞；P0凍存3-5支于一級種子罐中；P1、P2各凍存10支于次級種子罐中；復蘇與凍存順序相反；P2用于將來擴增凍存工作庫；凍存P0時瓶瓶取支原體樣品，送檢時取混合樣，有問題時，再送單瓶樣品；P0凍存后，若支原體陰性，則著手做SNP測試，以確定是目標鼠源肺癌細胞；鑒定成功后，永生化細胞模型命名為mLU6054-KRAS-G12D。

5.根據權利要求4所述的一種小鼠肺癌KRAS突變細胞模型的構建方法，其特征在于，所述mLU6054-KRAS-G12D用DMEM+10%FBS培養基培養。