[發(fā)明專利]一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的超微因子的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010768076.4
• 申請(qǐng)日: 2020-08-03
• 公開（公告）號(hào): CN111893093A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張海心
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)三禾生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 北京知呱呱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11577
• 代理人: 朱芳

本發(fā)明實(shí)施例公開了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的超微因子的制備方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)對(duì)傳代培養(yǎng)獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行超速離心分離、提取和透析純化得到，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得高純度、高密度的具有生物學(xué)活性的外泌體。該方法操作簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明實(shí)施例涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的超微因子的制備方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells)是一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，源于發(fā)育早期的中胚層，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，可以從骨髓、外周血、脂肪及皮膚等多種組織中獲得。間充質(zhì)干細(xì)胞屬于非終末分化細(xì)胞，它既有間質(zhì)細(xì)胞的特征，又有內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞的特征；作為一類多能干細(xì)胞，它在體外特定的誘導(dǎo)條件下，可以向骨、軟骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神經(jīng)、內(nèi)皮及胰島樣細(xì)胞等方向增殖分化。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中可以向培養(yǎng)基中分泌多種生物活性物質(zhì)，包括外泌體、微囊泡、細(xì)胞因子、microRNA、信號(hào)蛋白和活性肽等。其中部分活性物質(zhì)由于分子量過(guò)大或互相之間發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致其無(wú)法高效的通過(guò)人體屏障，在臨床應(yīng)用上存在一定的局限性。超微因子作為干細(xì)胞分泌的外泌體中所有活性物質(zhì)的總稱，其超低的分子量可以保證超微因子可以快速的穿過(guò)人體屏障，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮生物學(xué)功能，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。

目前關(guān)于超微因子的制備方法尚屬空白，因此，有必要對(duì)其制備方法進(jìn)行研究以滿足超微因子未來(lái)的開發(fā)與應(yīng)用的需求。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的超微因子的制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明實(shí)施例提供如下技術(shù)方案：

一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的超微因子的制備方法，包括以下步驟：

培養(yǎng)：將P1-P10代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)、待融合度達(dá)到80-90％后收集上清液，離心去除細(xì)胞碎片，得到包含超微因子的溶液；

分離：使用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾膜對(duì)所述包含超微因子的溶液進(jìn)行過(guò)濾，所得濾液在0-20℃，50000-200000g離心30-90min，棄上清；

提取：用無(wú)菌PBS重懸，加入提取液，顛倒混勻，0-20℃靜置2-24h后，在0-20℃，2000-10000g離心0.5-4h，所得沉淀即為粗制超微因子；

純化：用無(wú)菌PBS重懸，裝入透析袋，在0-20℃透析2-24h，即得到超微因子。