[發明專利]一種臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法

在審

• 申請號: 202010768076.4
• 申請日: 2020-08-03
• 公開（公告）號: CN111893093A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 張海心
• 申請（專利權）人: 沈陽三禾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京知呱呱知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 朱芳

1.一種臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

培養：將P1-P10代臍帶間充質干細胞接種在干細胞培養基中培養、待融合度達到80-90％后收集上清液，離心去除細胞碎片，得到包含超微因子的溶液；

分離：使用0.22μm無菌過濾膜對所述包含超微因子的溶液進行過濾，所得濾液在0-20℃，50000-200000g離心30-90min，棄上清；

提?。河脽o菌PBS重懸，加入提取液，顛倒混勻，0-20℃靜置2-24h后，在0-20℃，2000-10000g離心0.5-4h，所得沉淀即為粗制超微因子；

純化：用無菌PBS重懸，裝入透析袋，在0-20℃透析2-24h，即得到超微因子。

2.根據權利要求1所述的臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法，其特征在于，所述干細胞培養基為無動物源成分培養基。

3.根據權利要求1所述的臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法，其特征在于，所述離心去除細胞碎片的步驟包括：在0-20℃，800-1200g離心25min，取上清液，在0-20℃，800-1200g再次離心30min，保留上清液，即得到包含超微因子的溶液。

4.根據權利要求1所述的臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法，其特征在于，所述提取液通過以下方法獲得：將15-30g聚乙二醇和3-10g氯化鈉添加到80ml超純水中，溶解混勻，定容至100ml。

5.根據權利要求1所述的臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法，其特征在于，所述無菌PBS和提取液在使用前，進行0-20℃預冷處理。

6.根據權利要求1所述的臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法，其特征在于，所述P1-P10代臍帶間充質干細胞通過以下方法獲得：

(1)將臍帶快速置于臍帶保存液中；

(2)臍帶縱向剖開，剔除臍帶內的動靜脈血管，將所得華通氏膠剪成組織勻漿塊，濾網過濾；

(3)將過濾得到的組織勻漿塊平鋪于細胞培養皿，置于細胞培養箱孵育；

(4)待組織勻漿塊貼壁牢固后，向細胞培養皿中加入干細胞培養基，置于細胞培養箱內培養；

(5)24-48h后，棄去原有培養基，更換為新鮮培養基；

(6)待細胞培養皿中貼壁細胞鋪滿60-90％時，用0.25％胰蛋白酶消化，得到P0代細胞；

(7)將所得P0代細胞進行傳代，傳至P1-P10代時收獲細胞；

(8)對收獲的細胞進行鑒定及檢測。

7.根據權利要求6所述的臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述臍帶是健康、足月、行剖宮產的初產婦在胎兒娩出后結扎的人臍帶；所述臍帶保存液的組成如下：在PBS溶液的基礎上，添加1％青霉素鈉和1％硫酸鏈霉素。

8.根據權利要求6所述的臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述組織勻漿塊體積為1-2mm³；所述濾網孔徑為200目。

9.根據權利要求6所述的臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法，其特征在于，所述細胞培養箱條件為3-8％二氧化碳、溫度36-39℃、濕度85-100％；所述培養/孵育為靜置培養/孵育。

10.根據權利要求6所述的臍帶間充質干細胞來源的超微因子的制備方法，其特征在于，步驟(7)中，P0代細胞懸液按1：2-4的比例進行傳代接種培養，所得細胞記為第一代(P1)，待貼壁細胞生長鋪滿60-90％時，重復步驟(6)的操作，繼續進行傳代至P1-P10代。