[發明專利]一種利用海蟹共生煙曲霉制備抗癌活性化合物CHA的方法

在審

• 申請號: 202010766525.1
• 申請日: 2020-08-03
• 公開（公告）號: CN111944854A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 劉長青;顧乃瑜;陳歡;黃正洋;李朝霞;梁慧星;仇明
• 申請（專利權）人: 鹽城工學院
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12N1/14;G01N30/02;C12R1/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 錢超

本申請公開了一種利用海蟹共生煙曲霉制備抗癌活性化合物CHA的方法，涉及微生物培養基領域，特別是指一種用于發酵培養海蟹共生煙曲霉CY018，Aspergillus fumigatus制備生物堿類抗癌活性化合物Chaetominine即CHA的方法。

技術領域

本發明涉及微生物培養基技術領域，特別涉及一種利用海蟹共生煙曲霉制備抗癌活性化合物CHA的方法。

背景技術

海洋占據著地球表面近71%的面積，由于高鹽、高壓、低溫、低氧的環境，各種海洋生物必須與其共生菌長期共進化并建立穩定的互惠共生關系，其豐富了海洋生物的多樣性，并且能夠合成許多結構獨特且具有顯著生物活性的海洋天然產物，吸引許多專家學者從海洋中獲取天然產物。歷年來科學研究者發現的新天然產物呈逐年遞增的趨勢，其中具有抗癌活性的天然產物占據了63%的比例，而且FDA/EMA批準的海洋藥物中多數應用于癌癥的治療，可見，癌癥依舊是威脅人類健康的巨大隱患。故海洋共生菌被認為是新藥源分子的重要來源，對其產物深入研究可為人類抵抗癌癥等疾病有著較為深遠的影響。

海洋來源內生真菌菌株編號：CY018屬半知菌類、絲孢目(Hyphomycetales)、叢梗孢科(Moniliaceae)、曲霉屬(Aspergillus)真菌。海洋來源內生真菌CY018經液體或固體發酵可產生多種代謝物，包括生物堿類、萜類化合物、多烯類化合物和鞘氨酸類化合物等天然物質。CHA是其產生的一種生物堿類次級代謝物，CHA純品為無色顆粒狀結晶，對人白血病K562細胞系和人結腸癌SW1116細胞系具有同5氟尿嘧啶相媲美的抗癌活性，是一種潛在的抗癌制劑候選藥物。

然而，CHA的發酵產量目前已得到一定得提高，但是缺乏成熟有效的發酵策略及發酵放大工藝，制約CHA進行工廠化生產。因此，通過優化發酵放大工藝提高CHA產量已成為當務之急。

發明內容

解決的技術問題：本申請主要是提出一種利用海蟹共生煙曲霉制備抗癌活性化合物CHA的方法，解決現有技術中存在的得率相當低，CHA的產量低下等技術問題。利用槳葉末端線速度、通氣量相等的原則進行搖瓶、5L、50L、500L發酵工藝放大。培養基成分簡單，實驗操作方便，成本低廉，不需特殊設備，使用該發酵放大工藝可有效構建海蟹共生曲霉的抗癌活性生物堿CHA發酵放大、產量逐級提高。

技術方案：

一種利用海蟹共生煙曲霉制備抗癌活性化合物CHA的方法，包括如下步驟：

第一步，配制發酵培養基：稱取蔗糖120 g/L、乙酸銨5 g/L、七水合硫酸鎂0.84 g/L、七水合硫酸亞鐵0.016 g/L、磷酸二氫鉀1.2 g/L、酒石酸鈉2 g/L和谷氨酸鈉2.4 g/L，稱取后混合溶解制得發酵液，將發酵液分裝于三角瓶或反應器中，250 mL三角瓶中裝50 mL發酵液，5 L反應器中裝3 L發酵液，50 L反應器中裝30 L發酵液，500 L反應器中裝300 L發酵液，滅菌30min，冷卻后備用；

第二步，種子液發酵操作過程：將-80℃保存的海蟹共生煙曲霉解凍后，用接種針在固體平板培養基PDA中央進行點樣，置于28℃恒溫培養箱，活化培養7天，獲得新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養基，然后置于4℃冰箱保存，用接種鏟從新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養基中挖取1塊5×5 mm瓊脂塊，接種至裝有400 mL種子培養基PDB的1000 mL搖瓶中，以28℃、150 rpm搖床發酵培養72-96h，獲得新鮮種子液；

第三步：發酵操作過程；

第四步：pH測定；

第五步，發酵液總糖測定：取1 mL第三步的發酵液離心，吸取上清后，并稀釋100倍后備用，然后按照濃硫酸-苯酚檢測法檢測體系加入測試溶液，上下顛倒混勻，靜置30 min以待檢測，最后吸取200 μL反應后的溶液于96孔板中，在多功能酶標儀中以490 nm為檢測波長，檢測吸光值（A）；