[發(fā)明專利]一種利用海蟹共生煙曲霉制備抗癌活性化合物CHA的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010766525.1
• 申請日: 2020-08-03
• 公開（公告）號: CN111944854A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉長青;顧乃瑜;陳歡;黃正洋;李朝霞;梁慧星;仇明
• 申請（專利權(quán)）人: 鹽城工學(xué)院
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12N1/14;G01N30/02;C12R1/68
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 錢超

1.一種利用海蟹共生煙曲霉制備抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于包括如下步驟：

第一步，配制發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取蔗糖120 g/L、乙酸銨5 g/L、七水合硫酸鎂0.84 g/L、七水合硫酸亞鐵0.016 g/L、磷酸二氫鉀1.2 g/L、酒石酸鈉2 g/L和谷氨酸鈉2.4 g/L，稱取后混合溶解制得發(fā)酵液，將發(fā)酵液分裝于三角瓶或反應(yīng)器中，250 mL三角瓶中裝50 mL發(fā)酵液，5 L反應(yīng)器中裝3 L發(fā)酵液，50 L反應(yīng)器中裝30 L發(fā)酵液，500 L反應(yīng)器中裝300 L發(fā)酵液，滅菌30min，冷卻后備用；

第二步，種子液發(fā)酵操作過程：將-80℃保存的海蟹共生煙曲霉解凍后，用接種針在固體平板培養(yǎng)基PDA中央進行點樣，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，活化培養(yǎng)7天，獲得新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養(yǎng)基，然后置于4℃冰箱保存，用接種鏟從新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養(yǎng)基中挖取1塊5×5 mm瓊脂塊，接種至裝有400 mL種子培養(yǎng)基PDB的1000 mL搖瓶中，以28℃、150 rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)72-96h，獲得新鮮種子液；

第三步：發(fā)酵操作過程；

第四步：pH測定；

第五步，發(fā)酵液總糖測定：取1 mL第三步的發(fā)酵液離心，吸取上清后，并稀釋100倍后備用，然后按照濃硫酸-苯酚檢測法檢測體系加入測試溶液，上下顛倒混勻，靜置30 min以待檢測，最后吸取200 μL反應(yīng)后的溶液于96孔板中，在多功能酶標儀中以490 nm為檢測波長，檢測吸光值（A）；

第六步，菌體生物量測定：將全部第三步的發(fā)酵液用已稱重的定性濾紙真空抽濾，濾去上清液，將菌體用去離子水沖洗3遍并濾干、收集；隨后放入55℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，于干燥器中冷卻，細胞干重（Dry cell weight（DCW），g/L）采用減重法測定獲得；

第七步，CHA產(chǎn)量檢測：取50 mL所獲第三步的發(fā)酵液于250 mL錐形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30顆直徑為3 mm的玻璃珠，密封后，置于28 ℃和200 rpm搖床環(huán)境進行研磨、萃取1小時，并重復(fù)三次， 然后取3 mL上層有機相進行減壓旋轉(zhuǎn)蒸餾除去乙酸乙酯； 殘留物用1mL無水甲醇溶解； 在相對離心力為13000 rpm的條件下離心3分鐘后，取500 μL上清液，用高效液相色譜法測定CHA的含量，進而通過標準曲線換算成所述發(fā)酵液中CHA的實際含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用海蟹共生煙曲霉制備抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第一步滅菌條件為滅菌鍋中121℃下滅菌或通入蒸汽滅菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用海蟹共生煙曲霉制備抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第一步中將250 mL三角瓶中裝50 mL發(fā)酵液，第三步發(fā)酵操作過程為搖瓶發(fā)酵操作過程，取新鮮種子液，按14% (v/v)的接種量接入所述第一步的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以28℃、180 rpm搖床振蕩培養(yǎng)14天，獲得發(fā)酵液，在發(fā)酵120 h補加50 mM乙酸銨，第四步pH測定為利用pH計測定每次搖瓶取樣的發(fā)酵液中的pH，每次取3組平行試驗。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用海蟹共生煙曲霉制備抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第一步中5 L反應(yīng)器中裝3 L發(fā)酵液，第三步發(fā)酵操作過程為反應(yīng)器發(fā)酵，將400 mL新鮮種子液接種到5 L反應(yīng)器中，初始設(shè)定發(fā)酵通氣量：4.5 L/min；0.03%聚醚類消泡劑antifoam204；培養(yǎng)溫度：28±0.1℃；罐壓：0.03 MPa；接種量14%；裝液量：3 L；轉(zhuǎn)速：400 rpm，發(fā)酵周期16天；第四步pH測定為利用5 L反應(yīng)器中自帶的pH檢測器測定每次取樣的發(fā)酵液中的pH，每次取3組平行試驗。