[發明專利]一種利用海蟹共生煙曲霉生產抗癌活性化合物CHA的方法

在審

• 申請號: 202010765903.4
• 申請日: 2020-08-03
• 公開（公告）號: CN111961692A
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 劉長青;黃正洋;陳吉杰;湯雯婷;李朝霞;梁慧星;仇明
• 申請（專利權）人: 鹽城工學院
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12N1/14;C12R1/68
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 錢超

1.一種利用海蟹共生煙曲霉生產抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于包括如下步驟：

第一步，配制發酵培養基：按質量份數配比稱取葡萄糖10-36份、甘露醇20-24 份、硝酸鈉3.5 份、磷酸二氫鉀 0.5-1.5份、七水硫酸亞鐵 0.02-0.3份、七水硫酸鎂 0.7-2份、谷氨酸鈉 3-10份、酒石酸鈉 1.5 份中的一種或幾種混合物，以自來水溶解，并定容至1000 mL；

第二步，發酵操作過程：將-80℃保存的海蟹共生煙曲霉解凍后，用接種針在固體平板培養基PDA中央進行點樣，置于28℃恒溫培養箱，活化培養7天，獲得新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養基，然后置于4℃冰箱保存；

第三步：用接種鏟從新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養基中挖取1塊5×5 mm瓊脂塊，接種至裝有400 mL種子培養基PDB的1000 mL搖瓶中，以28℃、150 rpm搖床發酵培養24-96h，獲得新鮮種子液；

第四步：取新鮮種子液，按5-22% (v/v)的接種量接入第一步所述發酵培養基，以26-32℃、180 rpm搖床振蕩培養13天，獲得發酵液；

第五步，CHA產量檢測：取50 mL所獲發酵液于250 mL錐形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30顆直徑為3 mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200 rpm搖床環境進行研磨、萃取1小時，并重復三次，然后取3 mL上層有機相進行減壓旋轉蒸餾除去乙酸乙酯；殘留物用1 mL無水甲醇溶解；在相對離心力為13000 rpm的條件下離心3分鐘后，取500 μL上清液，用高效液相色譜法測定CHA的含量，進而通過標準曲線換算成所述發酵液中CHA的實際含量。

2. 根據權利要求1所述一種利用海蟹共生煙曲霉生產抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第一步發酵培養基的原料按質量份數配比除了葡萄糖10-36份、甘露醇20-24 份、硝酸鈉3.5 份、磷酸二氫鉀 0.5-1.5份、七水硫酸亞鐵 0.02-0.3份、七水硫酸鎂0.7-2份、谷氨酸鈉 3-10份、酒石酸鈉 1.5 份中的一種或幾種混合物，還含有麥芽糖20份、酵母提取物3份、玉米漿1份。

3.根據權利要求1所述一種利用海蟹共生煙曲霉生產抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第一步發酵培養基的原料按質量份數配比除了葡萄糖10-36份、甘露醇20-24份、硝酸鈉3.5 份、磷酸二氫鉀 0.5-1.5份、七水硫酸亞鐵 0.02-0.3份、七水硫酸鎂 0.7-2份、谷氨酸鈉 3-10份、酒石酸鈉 1.5 份中的一種或幾種混合物，還含有麥精20份、蛋白胨1份。

4.根據權利要求1所述一種利用海蟹共生煙曲霉生產抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第一步發酵培養基的原料按質量份數配比除了葡萄糖10-36份、甘露醇20-24份、硝酸鈉3.5 份、磷酸二氫鉀 0.5-1.5份、七水硫酸亞鐵 0.02-0.3份、七水硫酸鎂 0.7-2份、谷氨酸鈉 3-10份、酒石酸鈉 1.5 份中的一種或幾種混合物，還含有淀粉60份、檸檬酸銨12份、七水硫酸鋅0.005份、五水硫酸銅0.005份、七水硫酸錳0.01份。

5.根據權利要求1所述一種利用海蟹共生煙曲霉生產抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第三步中28℃、150 rpm搖床發酵培養24、30 h、36 h、42 h，獲得新鮮種子液。

6.根據權利要求1所述一種利用海蟹共生煙曲霉生產抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第四步中取新鮮種子液，按10%、14%、18%、22% (v/v)的接種量接入。

7.根據權利要求1所述一種利用海蟹共生煙曲霉生產抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第四步中以26、28、30、32 ℃，180 rpm搖床振蕩培養13天。