[發(fā)明專利]一種利用海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)抗癌活性化合物CHA的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010765903.4
• 申請(qǐng)日: 2020-08-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111961692A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉長(zhǎng)青;黃正洋;陳吉杰;湯雯婷;李朝霞;梁慧星;仇明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鹽城工學(xué)院
• 主分類號(hào): C12P7/62
• 分類號(hào): C12P7/62;C12N1/14;C12R1/68
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 錢超

本申請(qǐng)公開(kāi)了一種利用海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)抗癌活性化合物CHA的方法，涉及微生物培養(yǎng)基領(lǐng)域，特別是指一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海蟹共生煙曲霉CY018，Aspergillus fumigatus生產(chǎn)生物堿類抗癌活性化合物Chaetominine即CHA的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)抗癌活性化合物CHA的方法。

背景技術(shù)

海洋占據(jù)著地球表面近71%的面積，由于高鹽、高壓、低溫、低氧的環(huán)境，各種海洋生物必須與其共生菌長(zhǎng)期共進(jìn)化并建立穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系，其豐富了海洋生物的多樣性，并且能夠合成許多結(jié)構(gòu)獨(dú)特且具有顯著生物活性的海洋天然產(chǎn)物，吸引許多專家學(xué)者從海洋中獲取天然產(chǎn)物。歷年來(lái)科學(xué)研究者發(fā)現(xiàn)的新天然產(chǎn)物呈逐年遞增的趨勢(shì)，其中具有抗癌活性的天然產(chǎn)物占據(jù)了63%的比例，而且FDA/EMA批準(zhǔn)的海洋藥物中多數(shù)應(yīng)用于癌癥的治療，可見(jiàn)，癌癥依舊是威脅人類健康的巨大隱患。故海洋共生菌被認(rèn)為是新藥源分子的重要來(lái)源，對(duì)其產(chǎn)物深入研究可為人類抵抗癌癥等疾病有著較為深遠(yuǎn)的影響。

海洋來(lái)源內(nèi)生真菌菌株編號(hào)：CY018屬半知菌類、絲孢目(Hyphomycetales)、叢梗孢科(Moniliaceae)、曲霉屬(Aspergillus)真菌。海洋來(lái)源內(nèi)生真菌CY018經(jīng)液體或固體發(fā)酵可產(chǎn)生多種代謝物，包括生物堿類、萜類化合物、多烯類化合物和鞘氨酸類化合物等天然物質(zhì)。CHA是其產(chǎn)生的一種生物堿類次級(jí)代謝物，CHA純品為無(wú)色顆粒狀結(jié)晶，對(duì)人白血病K562細(xì)胞系和人結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞系具有同5氟尿嘧啶相媲美的抗癌活性，是一種潛在的抗癌制劑候選藥物。

然而，CHA在初始發(fā)酵工藝下的得率相當(dāng)?shù)停珻HA的產(chǎn)量低下已經(jīng)成為制約CHA用于臨床前研究的瓶頸。因此，通過(guò)改善其發(fā)酵工藝提高CHA產(chǎn)量已成為當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容

解決的技術(shù)問(wèn)題：本申請(qǐng)主要是提出一種利用海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)抗癌活性化合物CHA的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的得率相當(dāng)?shù)停珻HA的產(chǎn)量低下等技術(shù)問(wèn)題。解決限制對(duì)煙曲霉CY018次級(jí)代謝產(chǎn)物CHA產(chǎn)量提高研究的瓶頸問(wèn)題，發(fā)酵海蟹共生煙曲霉的抗癌活性生物堿CHA產(chǎn)量能顯著提高。

技術(shù)方案：

一種利用海蟹共生煙曲霉生產(chǎn)抗癌活性化合物CHA的方法，包括如下步驟：

第一步，配制發(fā)酵培養(yǎng)基：按質(zhì)量份數(shù)配比稱取葡萄糖10-36份、甘露醇20-24 份、硝酸鈉3.5 份、磷酸二氫鉀 0.5-1.5份、七水硫酸亞鐵 0.02-0.3份、七水硫酸鎂 0.7-2份、谷氨酸鈉 3-10份、酒石酸鈉 1.5 份中的一種或幾種混合物，以自來(lái)水溶解，并定容至1000 mL；

第二步，發(fā)酵操作過(guò)程：將-80℃保存的海蟹共生煙曲霉解凍后，用接種針在固體平板培養(yǎng)基PDA中央進(jìn)行點(diǎn)樣，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，活化培養(yǎng)7天，獲得新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養(yǎng)基，然后置于4℃冰箱保存；

第三步：用接種鏟從新鮮的海蟹共生煙曲霉的固體平板培養(yǎng)基中挖取1塊5×5 mm瓊脂塊，接種至裝有400 mL種子培養(yǎng)基PDB的1000 mL搖瓶中，以28℃、150 rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)24-96h，獲得新鮮種子液；

第四步：取新鮮種子液，按5-22% (v/v)的接種量接入第一步所述發(fā)酵培養(yǎng)基，以26-32℃、180 rpm搖床振蕩培養(yǎng)13天，獲得發(fā)酵液；