[發明專利]一種重組PCV2病毒樣顆粒蜂膠疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 202010764917.4
• 申請日: 2020-08-03
• 公開（公告）號: CN112010949B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 沈志強;曲光剛;武曰星;王長江;董林;程立坤;郭廣君
• 申請（專利權）人: 山東綠都生物科技有限公司;山東省濱州畜牧獸醫研究院
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C12N15/34;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/19
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺

本發明提供一種重組PCV2病毒樣顆粒疫苗制備方法，所述的制備方法是通過對豬圓環病毒2型Cap蛋白進行優化，并利用重組無內毒素大腸桿菌高密度發酵，獲得高表達量的豬圓環病毒2型病毒樣顆粒。本發明的豬圓環病毒2型Cap蛋白，其相比原始序列增加了一對二硫鍵，并對相應的序列片段進行優化，試驗結果表明，通過所述序列的優化增加了病毒樣顆粒疫苗的免疫原性，試驗結果表明，通過高密度發酵與高效表達實現了Cap蛋白的高效表達，10倍濃縮表達菌可獲得1:64?1:128的瓊擴效價；相比未優化的序列和其他佐劑的疫苗。

技術領域：

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種重組PCV2病毒樣顆粒蜂膠疫苗及其制備方法，尤其涉及，一種利用優化的PCV2 Cap蛋白基因和無致病性內毒素的大腸桿菌高密度發酵與高效表達技術實現高產量、低成本制備PCV2病毒樣顆粒蜂膠疫苗的方法、以及一種安全性更高、免疫效果更好的PCV2病毒樣顆粒蜂膠疫苗，既可以用于豬圓環病毒2型病免疫預防，又可以用于豬圓環病毒2型病緊急防治。

背景技術：

豬圓環病毒病（PCVD）是豬圓環病毒2型（PCV2）引起的一種重要傳染病，該病毒是一種小的致病性的單鏈DNA病毒，與豬皮炎與腎病綜合征、先天性震顫、后期流產和滲出性皮炎等疾病密切相關，給全球養豬業造成了嚴重的經濟損失。2009-2012年間，我國由PCV2感染所致的經濟損失高達150億元。豬圓環病毒疫苗是控制該病流行和減少養豬業損失的重要手段，2006年，在北美獲批第一種豬圓環病毒疫苗，我國自2009年開始陸續有豬圓環病毒2型滅活疫苗疫苗上市銷售，該滅活疫苗有全病毒和基因工程疫苗滅活疫苗兩種，但豬2型圓環病毒在體外培養的增值力不強，增殖滴度較低，其制備費用遠遠高于其他疫病的滅活疫苗，且生產中批間質量較難統一，生產工藝需要進一步改善。

Cap蛋白是PCV2病毒主要的衣殼蛋白，含有很多保護性抗原決定簇，是基因工程疫苗設計的靶標蛋白。目前市場上銷售的PCV基因工程疫苗有三類: 一類由桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統表達制備PCV2類病毒顆粒疫苗，該類疫苗有利于保證疫苗的穩定性和一致性，同時容易將免疫動物與感染動物區分開，便于疫苗效果的評價，但工藝要求較高，其價格昂貴，沒有市場競爭力，產品中可能會混有桿狀病毒顆粒，產生副反應，存在一定的生物安全風險。第二類是采用真核酵母菌進行表達，例如復旦大學2016年申請的發明專利CN201610806538.0公開了一種豬圓環病毒II型衣殼蛋白重組表達的馬克斯克魯維酵母工程菌，將豬圓環病毒II型衣殼蛋白基因克隆到表達載體中，并在馬克斯克魯維酵母中重組表達獲得豬圓環病毒II型病毒樣顆粒。發明專利CN201510091995.1也公開了采用畢赤酵母表達重組豬圓環病毒病毒樣顆粒(VLP)。第三類是將PCV2的ORF2基因(Cap蛋白)插入大腸桿菌原核載體中，利用大腸桿菌表達PCV 2 Cap蛋白，制備亞單位疫苗，大腸桿菌表達系統具有生長速度快、易培養、表達蛋白產量高、成本低廉等特點，但使用的佐劑為化學物質，不能激發良好的細胞免疫；不能用于緊急防治。

發明內容：

針對目前豬圓環病毒2型病毒樣顆粒疫苗及其制備方法存在的問題，本發明提供一種重組PCV2病毒樣顆粒疫苗制備方法，所述的制備方法是通過對豬圓環病毒2型Cap蛋白進行優化，并利用重組無致病性內毒素的大腸桿菌高密度發酵與高效表達技術，獲得高表達量的豬圓環病毒2型病毒樣顆粒，為控制PCV2提供更加有效的抗原。

一種豬圓環病毒2型Cap蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

一種編碼所述豬圓環病毒2型Cap蛋白的核酸分子，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO.2所示。

含有所述的核酸分子的載體，所述載體為重組表達載體或重組克隆載體，所述載體為由所述核酸分子插入pET28a載體得到。

含有所述重組表達載體的重組菌。