[發明專利]一種用于檢測樹突狀細胞中環狀RNA分布位置的方法

在審

• 申請號: 202010764877.3
• 申請日: 2020-07-31
• 公開（公告）號: CN111926061A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 周勤峰;唐寅;朱云鳳;楊萍;朱玲;趙玲;王娟;季蓉;沈輝;周謙;曹春園;陳慧;吳慕瑤;唐天翼
• 申請（專利權）人: 張家港市中醫醫院
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 陳望坡;黃春松

本發明公開了一種用于檢測樹突狀細胞中環狀RNA分布位置的方法，包括以下步驟：將明膠鋪在培養板；將樹突狀細胞鋪到培養板；將400μl 4%的多聚甲醛（PFA）加入到培養板中，室溫下放置后潤洗兩次；將200μl 0.1%的Triton加入到培養板并進行細胞破膜打孔，在室溫下放置后潤洗兩次；將1.5μg變性的DNA生物素探針加入到150μl預熱至55℃的RNA雜交液中，然后將該混合物立即加入到培養板中，棄去混合液，用RNA雜交清洗液潤洗兩次，然后將1μg/ml帶有紅色熒光標記的鏈霉親和素加入到培養板；將含有DAPI（1:5000）的PBS共染細胞核加入到培養板，置于熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光部分即為樹突狀細胞中環狀RNA的分布位置。本發明具有能確定樹突狀細胞中環狀RNA的分布位置的優點。

技術領域

本發明涉及生物醫療技術領域，具體涉及一種用于檢測樹突狀細胞中環狀RNA分布位置的方法。

背景技術

樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)是由骨髓祖細胞分化成的重要的免疫細胞，與先天性和適應性免疫反應密切相關。根據細胞發育分化的程度，DCs分為未成熟的樹突狀細胞(imDCs)和成熟的樹突狀細胞(mDCs)。未成熟的DCs低表達MHCII類分子、共刺激分子和黏附分子，能通過吞噬和巨胞飲作用(macropinocytosis)攝取抗原，但加工提呈抗原的能力較弱,不能激活T細胞。未成熟DCs一旦攝取抗原或受到炎性刺激即進入成熟階段，表型和功能均發生改變：高表達MHCII類分子、共刺激分子和黏附分子(如ICAM-1、DC-SIGN)，不表達FcR、CR和病原體受體。雖然攝取和加工抗原的能力降低，卻具有強大的提呈抗原能力，可以向T細胞提供抗原肽，啟動MHC I類限制性細胞毒性T細胞(CTL)反應和MHC II類限制性CD4⁺Th1反應。DCs是專業的抗原提呈細胞，在T細胞的激活、分化和功能中發揮著重要作用。根據其免疫功能，DCs可分為免疫反應性和免疫抑制性兩大類。前者激活T細胞，促進Th1分化，從而啟動免疫應答，而后者不能激活幼稚T細胞，但可以增強調節性T細胞(Tregs)。一般來說，imDCs具有免疫抑制作用，而mDCs具有免疫反應性。在器官移植中，imDCs的誘導已被用于抑制免疫、治療自身免疫性疾病和免疫排斥反應。

環狀RNA(circRNA)是一種新型的非編碼RNA，作為重要的基因調節因子，在細胞發育、增殖和疾病發生等多種生理病理過程中發揮著重要作用。環狀RNA作為當今研究的熱點，參與多種疾病發生、發展的調控，利用RNA-seq技術確定環狀RNA的表達量也越來越受到研究者的青睞。確定環狀RNA在樹突狀細胞中的分布，有利于進一步深入細胞調控機制的研究，但是樹突狀細胞中環狀RNA分布位置的檢測技術目前文獻中還未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種能快速準確地確定樹突狀細胞中環狀RNA分布位置的檢測方法。

為實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：一種用于檢測樹突狀細胞中環狀RNA分布位置的方法，包括以下步驟：

步驟(1)：將明膠均勻鋪在24孔培養板中，使其覆蓋培養板孔底，然后將培養板置于內部溫度為37℃的二氧化碳培養箱中至少2小時；

步驟(2)：將收集的樹突狀細胞(2x10^5)均勻鋪到步驟(1)的24孔培養板上，然后將培養板置于內部溫度為37℃的二氧化碳培養箱中，使樹突狀細胞充分粘附在24孔培養板上；

步驟(3)：將培養板從二氧化碳培養箱中取出，棄去上清液，然后用冷的(4℃)PBS輕輕加入到培養板中潤洗細胞兩次并棄去上清液；

步驟(4)：將至少400μl質量濃度為4％的多聚甲醛(PFA)加入到培養板中，然后將培養板在室溫下放置15～25分鐘后棄去上清液，接著用冷的(4℃)PBS潤洗細胞兩次并棄去上清液；