[發明專利]一種用于檢測樹突狀細胞中環狀RNA分布位置的方法

在審

• 申請號: 202010764877.3
• 申請日: 2020-07-31
• 公開（公告）號: CN111926061A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 周勤峰;唐寅;朱云鳳;楊萍;朱玲;趙玲;王娟;季蓉;沈輝;周謙;曹春園;陳慧;吳慕瑤;唐天翼
• 申請（專利權）人: 張家港市中醫醫院
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 陳望坡;黃春松

1.一種用于檢測樹突狀細胞中環狀RNA分布位置的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟(1)：將明膠均勻鋪在24孔培養板中，使其覆蓋培養板孔底，然后將培養板置于內部溫度為37℃的二氧化碳培養箱中至少2小時；

步驟(2)：將收集的樹突狀細胞(2x10^5)均勻鋪到步驟(1)的24孔培養板上，然后將培養板置于內部溫度為37℃的二氧化碳培養箱中，使樹突狀細胞充分粘附在24孔培養板上；

步驟(3)：將培養板從二氧化碳培養箱中取出，棄去上清液，然后用冷的(4℃)PBS輕輕加入到培養板中潤洗細胞兩次并棄去上清液；

步驟(4)：將至少400μl質量濃度為4％的多聚甲醛(PFA)加入到培養板中，然后將培養板在室溫下放置15～25分鐘后棄去上清液，接著用冷的(4℃)PBS潤洗細胞兩次并棄去上清液；

步驟(5)：將至少200μl質量濃度為0.1％的Triton加入到培養板中并進行細胞破膜打孔，然后將培養板在室溫下放置15分鐘；接著用冷的(4℃)PBS潤洗細胞兩次并棄去上清液；

步驟(6)：將1.5μg變性的DNA生物素探針加入到150μl預熱至55℃的RNA雜交液中，然后將該混合物立即加入到步驟(5)的培養板中，并在室溫下孵育2小時；

所述變性的DNA生物素探針與環狀RNA特異性連接點互補，經PCR合成；

所述RNA雜交液包含：摩爾濃度為5mol/L的NaCl,摩爾濃度為1mol/L的Tris-HCl,質量濃度為10％的SDS，質量濃度為100％甲酰胺，以及無菌水，上述各成分的體積比為：NaCl:Tris-HCl:SDS:甲酰胺:無菌水＝180:20:1:200:599；

步驟(7)：棄去培養板中的混合液，用RNA雜交清洗液潤洗細胞兩次，然后將1μg/ml帶有紅色熒光標記的鏈霉親和素streptavidin,Alex Flour^TM594 conjugate(Cat.#S11227,Invitrogen)加入到培養板中，并在室溫下避光孵育1.5小時，棄去上清液；然后用冷的(4℃)PBS潤洗細胞兩次，棄去上清液；

所述RNA雜交清洗液包含：摩爾濃度為5mol/L的NaCl,摩爾濃度為1mol/L的Tris-HCl,質量濃度為10％的SDS，摩爾濃度為0.5mol/L的EDTA，以及無菌水，上述各成分的體積比為：NaCl:Tris-HCl:SDS:EDTA:無菌水＝45:20:1:10:924；

步驟(8)：將含有DAPI(1:5000)的PBS加入到步驟(7)的培養板中共染細胞核，然后將培養板置于熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光部分即為樹突狀細胞中環狀RNA的分布位置。

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測樹突狀細胞中環狀RNA分布位置的方法，其特征在于：步驟(1)中的明膠為質量濃度為1％的明膠。

3.根據權利要求1所述的一種用于檢測樹突狀細胞中環狀RNA分布位置的方法，其特征在于：在步驟(4)中，將至少400μl質量濃度為4％的多聚甲醛(PFA)加入到培養板中，然后將培養板在室溫下放置20分鐘后棄去上清液，接著用冷的(4℃)PBS潤洗細胞兩次并棄去上清液。