[發明專利]一種黃草烏胚狀體的誘導培養方法

有效

• 申請號: 202010764866.5
• 申請日: 2020-08-03
• 公開（公告）號: CN111802248B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 李昆志;李一果
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明同聚專利代理有限公司 53214
• 代理人: 蘇蕓蕓

本發明公開了一種黃草烏胚狀體的誘導培養方法，該方法以黃草烏珠芽為外植體，珠芽消毒后先誘導出愈傷組織，從愈傷組織中選取顏色為帶綠色的鵝黃色、分裂旺盛的胚性愈傷組織進行誘導培養，獲得黃草烏胚狀體，為黃草烏優質種苗的大量培育和快速繁殖提供了一條新途徑，可有效解決當前黃草烏植物資源和種苗資源短缺，以及病害嚴重等問題。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種黃草烏胚狀體的誘導培養方法。

背景技術

黃草烏（Aconitum vilmorinianum Kom.）為毛茛科烏頭屬多年生草質藤本植物，其塊根有劇毒，具有祛風散寒、除濕止痛、解毒消腫等功效，常用于治療跌打損傷、風濕痛、寒濕痹、手足厥冷、瘡毒等癥。黃草烏作為一種重要的中藥材，長期以來主要以直接采挖野生資源供藥用，遭到過度采挖，數量急劇減少。近年來，開始人工種植以解決資源匱缺的問題，主要采用種子繁殖、珠芽繁殖和小塊根繁殖等方式。然而由于種子繁殖變異較大，而塊根和珠芽繁殖后代的病害嚴重，因此，優質黃草烏種苗生產成為一個亟待解決的生產問題。胚狀體誘導再生黃草烏植株，繁殖率高，病毒積累少，種苗健壯，可為黃草烏優質種苗生產提供一種新的途徑。

胚狀體是在植物細胞、組織或器官體外培養過程中，由一個或一些體細胞經過胚胎發生和發育過程，形成與合子胚相類似的結構，可進一步發育成植株。在體外，由體細胞可產生類似胚胎的結構，如某些植物以特定部位為外植體，通過組織培養，在特定條件下可能產生胚狀體。胚狀體的發育過程與合子胚類似，經過原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚及子葉胚等幾個階段，在其發生的最早階段就具有兩極性，即根端（胚根）和莖端（胚芽），并且與母體細胞或外植體的維管束無直接連系，可以得到無病植株；說明胚狀體一開始就是一個完整植物的雛形，可通過根端或類似胚柄結構從外植體或愈傷組織獲取營養，也很容易從愈傷組織表面脫離下來，在適宜條件下長成新的植株，為快速生產種苗提供了新的途徑。

艾洪蓮等（2015）探討了不同溫度、激素和化學試劑對黃草烏種子發芽率和發芽指數的影響，20℃為黃草烏種子萌發的最適溫度，GA₃浸泡24h可顯著提高種子的發芽率，5℃低溫處理35d可顯著縮短種子的萌發時間，適合大規模生產。沈芳晨（2018）以黃草烏種子為外植體，種子經75%酒精消毒30s，10% NaCl消毒30min，在MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA芽誘導培養基中萌發，100mg/L濃度GA₃對黃草烏種子進行打破休眠處理，摸索黃草烏種子萌發體系的最適培養條件。目前僅有利用黃草烏種子和珠芽進行擴繁的申請，如“用黃草烏種子進行擴繁的方法”（申請號CN201610666910.2）通過培育場地選擇、場地平整操作和消毒處理、漂浮育苗系統，可有效避免黃草烏塊根的使用，降低擴繁培育成本30～40%，提高黃草烏經濟收益率；“黃草烏珠芽繁殖技術”（申請號CN201610031105.2）通過珠芽的分批采集，經貯藏、消毒、分級，可有效避免側生塊根繁殖不易保存、在保存過程中易發病及易引起連作帶來的危害等一系列問題。目前還未見將黃草烏珠芽培養出原球莖胚性細胞后，再進一步由原球莖胚性細胞誘導培養出黃草烏胚狀體的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種黃草烏胚狀體的誘導培養方法，該方法利用黃草烏珠芽誘導培育出的黃草烏胚狀體，黃草烏胚狀體具有胚的特性，在適當的條件下可快速生長為再生的無病植株，能有效解決黃草烏生產中種苗短缺的問題，實現黃草烏優質種苗的快速繁殖。

本發明黃草烏胚狀體的誘導培養方法包括以下步驟：

（1）珠芽選擇：選擇黃草烏生長健壯的植株，剪取葉腋間幼嫩的珠芽作為外植體；

（2）珠芽消毒：將步驟（1）選取的黃草烏珠芽在體積濃度75%的乙醇溶液中消毒20～60s，用無菌水清洗4～6次，然后放入質量濃度0.1%的HgCl₂溶液中消毒10～15min，再用無菌水清洗4～6次，用無菌紙吸干水分；