[發明專利]紅嘴鷗IFNα蛋白克隆表達及多抗制備

在審

• 申請號: 202010764526.2
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111925433A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 常華;項勛;代飛燕;段綱;楊林富;段博芳;曾邦全
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C07K14/56
• 分類號: C07K14/56;C12N15/21;C12N15/70;C07K16/24;C07K16/06
• 代理公司: 北京隆達恒晟知識產權代理有限公司 11899
• 代理人: 楊青

本發明涉及紅嘴鷗IFNα蛋白克隆表達及多抗制備，屬于生物工程技術領域，本發明提供了紅嘴鷗IFNα蛋白克隆表達及多抗制備，克隆紅嘴鷗α干擾素基因部分片段，構建原核表達重組載體，獲得重組蛋白制備多抗，為后期其抗病毒活性，及紅嘴鷗α干擾素基因抗病毒機制研究提供理論基礎，為紅嘴鷗疫病防控另辟新徑，對獸醫公共衛生也有著較深的影響。在進行免疫兔子時，選擇應用弗氏完全佐劑與不完全佐劑配合蛋白注射，可高效快速的制備到多克隆抗體。制備得到的抗體，經瓊擴試驗驗證可知，紅嘴鷗IFNα基因部分片段重組蛋白有較好的免疫原性，抗體效價可以達到1：8。可以較好的用于后續紅嘴鷗IFNα蛋白抗病毒機制的研究。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體的說，涉及紅嘴鷗IFNα蛋白克隆表達及多抗制備。

背景技術

遷徙是候鳥的一種本能活動，為了逃避環境及氣候對其造成的威脅，候鳥選擇遷徙到不同的地方生存。在遷徙過程中，其容易攜帶包括寄生蟲性、細菌性、病毒性病原。鳥類作為病原攜帶者，其對其他易危、瀕危鳥類的生存甚至是棲息地周圍人類健康也構成潛在威脅。近來有報道，禽流感爆發與候鳥遷徙關系密切，目前為止，禽流感己經從數百種野鳥中分離。除禽流感外，候鳥遷徙過程還會攜帶其他諸如禽流感、傳支等病原，對遷徙地周圍家禽健康造成潛在威脅。

紅嘴鷗作為遷徙比較頻繁的候鳥，每年冬季其大量從北方西伯利亞地區遷徙到中國南方越冬，人們喜歡在湖邊觀鷗，對其進行飼喂，與紅嘴鷗便有了近距離接觸。這容易增加了人鷗共患病發生的可能性，特別是紅嘴鷗在遷徙過程中可能帶來的一些重大的人獸共患病，諸如禽流感等重大動物疫病。盡管目前還未爆發紅嘴鷗大規模的疫情，但已有紅嘴鷗在長途遷徙過程中曾感染禽流感病毒的可靠數據。為此紅嘴鷗自身免疫系統抗病毒機理的研究十分重要，這為以后疾病的防制奠定基礎。

對于紅嘴鷗來講，其免疫系統的相關研究未有報道，其涉及研究內容較多，選擇重要的研究切入點較為關鍵。禽類干擾素被分為I類、II類和III類。其中，I型干擾素的出現較早，有著廣譜抗病毒作用。α干擾素(IFNα)是I類干擾素，是免疫相關細胞產生的一種高活性、多功能的生物活性糖蛋白，具有抗病毒作用，其對病毒復制的抑制作用沒有選擇性。IFNα產品在臨床上應用廣泛，在哺乳動物及家禽上研究較多，但關于野生遷徙鳥類如紅嘴鷗IFNα的研究還未見報道。

發明內容

為了克服背景技術中存在的問題，本發明提供了紅嘴鷗IFNα蛋白克隆表達及多抗制備，擬克隆紅嘴鷗α干擾素基因部分片段，構建原核表達重組載體，獲得重組蛋白制備多抗，為后期其抗病毒活性，及紅嘴鷗α干擾素基因抗病毒機制研究提供理論基礎，為紅嘴鷗疫病防控另辟新徑，對獸醫公共衛生也有著較深的影響。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供了一種紅嘴鷗IFNα蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明提供了一種編碼紅嘴鷗IFNα蛋白的基因，其基因編碼如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明提供了一種紅嘴鷗IFNα克隆表達的方法，包括以下步驟：

1)分離紅嘴鷗血液淋巴細胞，提取總RNA，將RNA反轉錄為cDNA；

2)設計擴增引物，PCR擴增獲得紅嘴鷗IFNα基因部分片段；

3)將pMD18-T載體與純化的IFNα基因部分片段進行連接，連接產物轉化至感受態細胞DH5α進行培養，將培養后的菌液提取核酸后采用PCR及EcoR I與Xho I雙酶切方法進行雙重鑒定，獲得重組質粒pMD18-T-IFNα-1；

4)用EcoR I與Xho I酶切重組質粒pMD 18T-IFNα-1，獲得目的片段IFNα-1。

進一步優選，所述的紅嘴鷗IFNα克隆表達的方法還包括以下步驟：