[發明專利]紅嘴鷗IFNα蛋白克隆表達及多抗制備

在審

• 申請號: 202010764526.2
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111925433A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 常華;項勛;代飛燕;段綱;楊林富;段博芳;曾邦全
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C07K14/56
• 分類號: C07K14/56;C12N15/21;C12N15/70;C07K16/24;C07K16/06
• 代理公司: 北京隆達恒晟知識產權代理有限公司 11899
• 代理人: 楊青

1.一種紅嘴鷗IFNα蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

2.一種編碼紅嘴鷗IFNα蛋白的基因，其特征在于：所述基因編碼如權利要求1所述蛋白的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

3.一種紅嘴鷗IFNα克隆表達的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）分離紅嘴鷗血液淋巴細胞，提取總RNA，將RNA反轉錄為cDNA；

2）設計擴增引物，PCR擴增獲得紅嘴鷗IFNα基因部分片段；

3）將pMD18-T載體與純化的IFNα基因部分片段進行連接，連接產物轉化至感受態細胞DH5α進行培養，將培養后的菌液提取核酸后采用PCR及EcoR I與Xho I雙酶切方法進行雙重鑒定，獲得重組質粒pMD18-T-IFNα-1；

4）用EcoR I與Xho I酶切重組質粒pMD 18T-IFNα-1，獲得目的片段IFNα-1。

4.根據權利要求3所述的紅嘴鷗IFNα克隆表達的方法，其特征在于：還包括以下步驟：

5）重組原核表達載體的構建

將目的片段紅嘴鷗IFNα-1插入pET32a(+)載體的EcoR I和Xho I酶切位點之間，構建得到重組原核表達載體pET32a-IFNα-1。

5.根據權利要求3或4所述的紅嘴鷗IFNα克隆表達的方法，其特征在于：步驟2）中，擴增引物序列如下：

F：GAA TTC CTG CTC CTC CTG ACG GCT ；

R：CTC GAG CTA ATT GCA CAT GGT GCG GGT GAG；擴增片段大小為537bp。

6.根據權利要求3-5任一項所述的紅嘴鷗IFNα克隆表達的方法，其特征在于：步驟2）中，PCR反應條件為：95℃預變性2min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延展1min，35個循環；72℃ 延展10min。

7.一種紅嘴鷗IFNα蛋白的制備方法，其特征在于：將權利要求4、5或6制備的紅嘴鷗IFNα原核表達載體轉化至Rosetta感受態細胞中，經IPTG誘導表達，獲得紅嘴鷗IFNα重組蛋白。

8.根據權利要求7所述的紅嘴鷗IFNα蛋白的制備方法，其特征在于：菌液OD₆₀₀值約0.5-0.6時，誘導表達條件為加入1 mmol/ml IPTG于37℃條件下誘導表達5h。

9.一種紅嘴鷗IFNα多克隆抗體的制備方法，其特征在于：將權利要求1-8任一項獲得的紅嘴鷗IFNα蛋白作為抗原免疫兔子，接種方法如下：

1）免疫原的準備：首免時將蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合，在冰上超聲乳化5min，在進行二免和三免時蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合后在冰上超聲乳化30min；

2）免疫程序：一免：完全佐劑+抗原，抗原注射劑量為1mg/只，足底皮內注射；二免：不完全佐劑+抗原，抗原注射劑量為1mg/只，腹部皮內注射；三免：不完全佐劑+抗原，抗原注射劑量為1.5mg/只，脊背、腹部皮下注射；

3）在三免后14天頸動脈放血，分離血清即可得多克隆抗體。

10.一種紅嘴鷗IFNα多克隆抗體，其特征在于：該多克隆抗體根據權利要求9的方法制備得到。