[發明專利]一種基于草銨膦為篩選標記的甜瓜遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 202010761342.0
• 申請日: 2020-07-31
• 公開（公告）號: CN111926033A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 黃丹楓;劉斌;楊森;牛慶良;張屹東
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/34
• 代理公司: 上海段和段律師事務所 31334
• 代理人: 陳少凌;郭國中

本發明提供了一種基于草銨膦為篩選標記的甜瓜遺傳轉化方法；包括：1)構建帶有BlpR基因的重組表達載體，轉入農桿菌得到重組菌株；2)在無菌環境下，采用該重組農桿菌侵染甜瓜子葉近軸端片段，將侵染后的子葉片段置于共培養基上生長，得到膨大的子葉外植體；3)將膨大的外植體轉移至分化篩選培養基上培養，誘導出叢生芽；4)將伸長的叢生芽分離成單株，轉移、進一步篩選培養，得到具有甜瓜地上部分的幼苗；5)將具有甜瓜地上部分的幼苗轉入生根培養基中，誘導根的分化，得到T0代甜瓜轉基因幼苗；6)通過草銨膦試紙和PCR雙重鑒定T0代甜瓜轉基因幼苗，得到完成遺傳轉化的株系。利用本發明的方法可以得到穩定轉化的甜瓜幼苗。

技術領域

本發明屬于植物分子遺傳育種和基因工程技術領域，涉及一種甜瓜高效遺傳轉化及轉基因植株鑒定方法，具體涉及一種基于草銨膦為篩選標記的甜瓜遺傳轉化方法。

背景技術

甜瓜(Cucumis melo L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬(Cucumis)一年蔓生的草本植物，是重要的園藝作物之一。由于甜瓜屬作物的遺傳基礎狹窄，傳統育種技術對新品種的培育受限于種內與種間雜交隔離，很多重要的性狀無法通過常規育種方法進行改良。此外，傳統育種技術耗時較長，效率較低。與之相比，轉基因技術具有高效性、精準性等優點，且逐漸被用于農作物的品種改良中。然而，甜瓜的遺傳轉化技術尚不成熟，相關研究工作也進展緩慢。

對現有專利文獻檢索發現，CN102080100A公開了一種農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法，包括以甜瓜子葉或子葉節為外植體，將外植體浸入農桿菌菌液中浸泡，隨后在培養基中誘導、培養芽，待芽長到高1-3cm高時，在培養基中生根、移栽。該方法提高了甜瓜的轉化效率，解決了甜瓜利用農桿菌轉化的難度問題。然而，該方法在轉基因植株鑒定上采用PCR技術，工作量大，費時費力；且轉化效率提升有限。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高效的基于草銨膦為篩選標記的甜瓜遺傳轉化方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

本發明涉及一種農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法，所述方法包括如下步驟：

1)構建帶有BlpR基因的重組表達載體，轉入農桿菌得到重組菌株；

2)在發芽培養基中促進甜瓜種子發芽得到子葉；在無菌環境下，采用步驟1)獲得的重組農桿菌侵染甜瓜子葉近軸端片段，將侵染后的子葉片段置于“植物-農桿菌共培養培養基”上生長，得到膨大的子葉外植體；

3)將膨大的子葉外植體轉移至分化篩選培養基上培養，誘導出叢生芽；

4)將伸長的叢生芽分離成單株，并(轉移至更大空間的容器中)進一步篩選培養，得到具有甜瓜地上部分的幼苗；

5)將具有甜瓜地上部分的幼苗轉入生根培養基中，誘導根的分化，得到T0代甜瓜轉基因幼苗；

6)通過草銨膦試紙和PCR雙重鑒定T0代甜瓜轉基因幼苗，得到完成遺傳轉化的株系。

作為本發明的一個實施方案，步驟6)具體包括如下步驟：

6-1)用草銨膦噴灑步驟5)中的甜瓜幼苗，不枯死的幼苗即為遺傳轉化的植株，發生枯死的幼苗不為遺傳轉化植株；

和/或，6-2)將步驟5)中的甜瓜幼苗葉片用水磨碎，將草銨膦試紙條放入研磨液中，測試結果產生陽性目標條帶的即為遺傳轉化的植株，無目標陽性條帶的不為遺傳轉化植株；

和/或，6-3)提取步驟5)中的甜瓜幼苗葉片DNA，利用PCR擴增表達載體上的特異DNA序列，并測序；有條帶且測序結果與載體序列一致的為遺傳轉化的植株；有條帶但測序不正確，或沒用擴增條帶的不為遺傳轉化植株。