[發明專利]一種基于草銨膦為篩選標記的甜瓜遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 202010761342.0
• 申請日: 2020-07-31
• 公開（公告）號: CN111926033A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 黃丹楓;劉斌;楊森;牛慶良;張屹東
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/34
• 代理公司: 上海段和段律師事務所 31334
• 代理人: 陳少凌;郭國中

1.一種農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1)構建帶有BlpR基因的重組表達載體，轉入農桿菌得到重組菌株；

2)在發芽培養基中促進甜瓜種子發芽得到子葉；在無菌環境下，采用步驟1)獲得的重組農桿菌侵染甜瓜子葉近軸端片段，將侵染后的子葉片段置于植物-農桿菌共培養培養基上生長，得到膨大的子葉外植體；

3)將膨大的子葉外植體轉移至分化篩選培養基上培養，誘導出叢生芽；

4)將伸長的叢生芽分離成單株，進一步篩選培養，得到具有甜瓜地上部分的幼苗；

5)將具有甜瓜地上部分的幼苗轉入生根培養基中，誘導根的分化，得到T0代甜瓜轉基因幼苗；

6)通過草銨膦試紙和PCR雙重鑒定T0代甜瓜轉基因幼苗，得到完成遺傳轉化的株系。

2.根據權利要求1所述的農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法，其特征在于，步驟6)具體包括如下步驟：

6-1)用草銨膦噴灑步驟5)中的甜瓜幼苗，不枯死的幼苗即為遺傳轉化的植株，發生枯死的幼苗不為遺傳轉化植株；

和/或，6-2)將步驟5)中的甜瓜幼苗葉片用水磨碎，將草銨膦試紙條放入研磨液中，測試結果產生陽性目標條帶的即為遺傳轉化的植株，無目標陽性條帶的不為遺傳轉化植株；

和/或，6-3)提取步驟5)中的甜瓜幼苗葉片DNA，利用PCR擴增表達載體上的特異DNA序列，并測序；有條帶且測序結果與載體序列一致的為遺傳轉化的植株；有條帶但測序不正確，或沒用擴增條帶的不為遺傳轉化植株。

3.根據權利要求1或2所述的農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法，其特征在于，

步驟2)中，用于侵染的重組農桿菌先后經LB、B5液體培養基培養至菌液OD值為0.4-0.6。

4.根據權利要求3所述的農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法，其特征在于，用于侵染的重組農桿菌先在含50-150mg/L利福平和50-150mg/L壯觀霉素的LB液體培養基過夜培養，再吸取該過夜培養得到的侵染液0.5-5mL，加入100-150mL B5液體培養基中，再加入40-80ul400mM的乙酰丁香酮，再次過夜培養至菌液OD值為0.4-0.6。

5.根據權利要求1中所述的農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法，其特征在于，

所述發芽培養基為MS固體培養基，不含任何激素；

和/或，所述植物-農桿菌共培養培養基為含有0.4-0.6mg/L 6-BA和0.05-0.15mg/LIAA的B5固體培養基；

和/或，所述分化篩選培養基為含有0.4-0.6mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L IAA、100-200mg/L特美汀，200-300mg/L頭孢噻肟和3.5-5mg/L草銨膦的B5固體培養基；

和/或，所述生根培養基為B5固體培養基，不含任何激素。

6.根據權利要求1中所述的農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法，其特征在于，步驟2)中，發芽培養基中催芽培養時間為20-24小時；催芽和子葉共培養均在光照條件下進行。

7.根據權利要求1中所述的農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法，其特征在于，所述甜瓜為栽培甜瓜或野生甜瓜。

8.根據權利要求1中所述的農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法，其特征在于，步驟1)中，所述重組表達載體能表達BlpR蛋白質；所述BlpR蛋白質為序列表中SEQ ID NO.1所示蛋白質。

9.一種試劑，為所述發芽培養基、植物-農桿菌共培養基、分化篩選培養基和生根培養基組成的成套培養基；所述發芽培養基為MS固體培養基；所述植物-農桿菌共培養基為含有0.4-0.6mg/L 6-BA和0.05-0.15mg/L IAA的B5固體培養基；所述分化篩選培養基為含有0.4-0.6mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L mg/L IAA、100-200mg/L特美汀，200-300mg/L頭孢噻肟和3.5-5mg/L草銨膦的B5固體培養基；所述生根培養基為B5固體培養基。

10.下述任一應用

Y1)權利要求1-8中任一所述方法在甜瓜育種中的應用；

Y2)權利要求9中所述試劑在甜瓜育種中的應用；

Y3)權利要求9中所述試劑在制備甜瓜遺傳轉化產品中的應用；

Y4)權利要求9中所述試劑在甜瓜遺傳轉化中的應用。