[發明專利]一種大規模發酵鐵蛋白的方法

有效

• 申請號: 202010760119.4
• 申請日: 2020-07-31
• 公開（公告）號: CN111733123B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 柯天一;姚德惠;勞芳;張澤譯;希倫;丁鳳姣;王曉飛
• 申請（專利權）人: 昆山新蘊達生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/00;C07K14/47;C12R1/19
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 宋秀蘭

本發明涉及生物醫學工程技術領域，具體涉及一種大規模發酵鐵蛋白的方法。所述方法包括使用不含微量元素的發酵培養基，并優化了發酵條件。本發明的方法發酵效率高、成本低、制備的鐵蛋白載藥效果好、質量均一穩定。

技術領域

本發明涉及生物醫學工程技術領域，具體涉及一種大規模發酵鐵蛋白的方法。

背景技術

鐵蛋白是一類廣泛存在于動物、植物及微生物中的天然鐵貯存蛋白。在人體或其他哺乳動物體內分離的鐵蛋白通常由兩種不同的鐵蛋白亞基（H亞基和L亞基）構成，H亞基和L亞基的分子質量分別為21 kDa和19 kDa。典型的鐵蛋白結構是由24個H亞基/L亞基自組裝形成的籠狀結構，外徑12nm，內部形成直徑8nm的內腔結構。籠狀結構容納包含多達4500個鐵原子的鐵核。

由于鐵蛋白其具有可包裹藥物的籠狀結構、顯著的穩定性、較小且均一的尺寸，本領域已經嘗試將鐵蛋白用作藥物載體以遞送藥物，例如可見Ferritin-based drugdelivery systems: Hybrid nanocarriers for vascular immunotargeting, MakanKhoshnejad et.al, Journal of Controlled Release 282 (2018) 13-24。

WO2015180325A1描述了由重組方法制備獲得的僅由H亞基自組裝成的鐵蛋白(HFn)，由于其能夠與受體TfR1結合而靶向腫瘤細胞，從而可以用作腫瘤特異性給藥的藥物載體。WO2018153372A1則教導了HFn可用作能夠穿越血腦屏障的納米藥物載體。此外，重組鐵蛋白還可作為醫學成像、延長活性藥物半衰期、診斷檢測等用途。

與其他納米藥物載體相比，鐵蛋白由于來自生物體內，是一種天然存在的蛋白質，不具備免疫原性，且其空腔內載藥量大，加上HFn的主動腫瘤靶向性，因此具有廣闊的作為藥物遞送載體的應用前景。

采用基因工程方法可以獲得重組的鐵蛋白。但是，目前通過重組技術制備鐵蛋白的方法多處于實驗室或小試階段，缺乏大規模發酵培養的成熟工藝。如中國專利申請CN101921798A公開了一種基因重組人鐵蛋白輕鏈的制備方法，該專利申請使用LB培養基進行搖瓶培養，是實驗室規模的小量培養方式，發酵效率低，該發酵方法不適合包載藥物，不適用于大規模發酵培養。CN104017089A公開了一種HFn納米粒子的制備方法和用途，其同樣是采用LB培養基搖瓶小規模培養，且其重點在于鐵蛋白亞基的復性而非發酵工藝的研究。

另外，由于發酵過程中一系列因素的影響，使得制備的鐵蛋白純化難度大，費用高，導致載藥量低、雜質多、穩定性差等問題。如中國專利申請CN1257931A公開了一種可用于人體補鐵的鐵蛋白及其制備方法和應用，但其發酵過程中菌體生長速率較低，而且制備的鐵蛋白是補鐵用的菌劑，包載藥物的效果較差。

因此，本領域需要開發一種適宜大規模制備鐵蛋白，即發酵效率高、成本低、鐵蛋白質量均一、穩定、易純化的鐵蛋白發酵方法。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足而提供一種發酵效率高、成本低、易于規模化操作、工藝穩定性優異的鐵蛋白的發酵方法。

本發明的一個方面，是提供一種發酵制備鐵蛋白的方法，所述方法包括如下步驟：

（1）將包含鐵蛋白編碼基因的重組大腸桿菌的種子液接種于發酵培養基中進行培養；

（2）發酵培養至OD₆₀₀在30-60時，加入誘導劑，得到發酵液；

（3）收集發酵液中的菌體；

（4）破碎收集的菌體，離心，取上清液，即得。

所述的發酵培養基由如下組分組成：酵母蛋白胨、酵母抽提物、氯化鈉、氯化銨、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂和葡萄糖。