[發明專利]一種檢測大豆線蟲的引物和探針及方法

在審

• 申請號: 202010757312.2
• 申請日: 2020-07-31
• 公開（公告）號: CN111662991A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 吳驍軼;王斌
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6804;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 丁靜靜

本發明公開了一種檢測大豆線蟲的引物和探針，包括如下核苷酸序列：(1)檢測線蟲病的PCR引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；(2)檢測胞囊線蟲的探針：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；(3)檢測結線蟲的探針：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。本發明還公開了利用核酸層析試紙檢測大豆線蟲的方法，不能發明具有特異性強、靈敏度高、操作簡便等特點，生產所需的耗材、設備成本不高，可大規模推廣使用。

技術領域

本發明屬于植物病原菌檢測技術領域，具體涉及一種檢測大豆線蟲的引物和探針及方法。

背景技術

大豆作為人類食物和動物飼料的主要來源，豆科植物在自然和農業生態系統中發揮著重要作用，并為工業生產提供大量基礎原料。近年來，隨著居民消費結構升級，大豆需求量高速增加，當前，中國已成為世界上最大的大豆消費國。為了應對復雜的國際貿易環境，我國積極振興大豆產業，提高種植面積和單位面積產量，提升國產大豆自給能力。國家糧油信息中心預計，2019年我國大豆播種面積為1.3275億畝，同比增長5.4％，其中黑龍江大豆播種面積為5730億畝，同比增長7.0％。雖然正在擴大其種植規模，目前我國大豆的對外依存度依然超過80％。2019年1-3季度中國大豆進口量為6451萬噸，是中國進口量最大的農產品。

隨著種植面積和進口量的增長，檢疫病害跨境傳播的風險也在增加。線蟲是大豆上的主要病害之一，包括胞囊線蟲和根結線蟲兩大類，嚴重可導致減產70-80％，每年會造成約10億美元的經濟損失。其中，大豆胞囊線蟲(Soybean cyst nematode)發病會感染植株明顯矮化，生長瘦弱，葉片由下而上發黃，通常呈點片狀，花期延遲，籽粒瘦小或不結莢，嚴重時會成片枯死。大豆根節線蟲(Soybean Root-knot nematode)發病會使豆根受線蟲刺激，形成節狀瘤，病瘤大小不等，形狀不一，有的小如米粒，有的形成“根結團”，表面粗糙，瘤內有線蟲。病株矮小，葉片黃化，嚴重時植株萎蔫枯死，田間成片黃黃綠綠，參差不齊。為了控制線蟲危害，國內外采取了包括物理、化學、生物、栽培措施在內的多種防治方法，而有效的檢疫手段是線蟲防治的關鍵。

目前的植物檢疫手段主要有形態學檢測、生化檢測和分子生物學方法等(PCR-跑膠、ITS-PCR-RFLP、實時熒光定量PCR法等)。這些方法檢測準確度高、低污染的特點，但是需要電泳、染色、成像等多個步驟，對檢測耗時、費力，對設備依賴程度高，傳統檢測方法不能適應大面積作物現場檢測或進口檢疫場景下大規模篩查的需要。

免疫層析試紙條(Immunochromatography test strip，ICTS)是一種將生物化學交聯、層析分析技術等技術方法有機集合在一起的固相標記免疫檢測技術，是目前常用的快速檢測方法之一。免疫層析試紙可結合PCR、多重PCR、等溫擴增技術等多種核酸擴增技術，通過對擴增目的產物進行熒光素標記，利用相應的抗體來實現特異性檢測。由于其操作簡單、省時、制造成本低、對設備依賴程度較低，結果易判定的特點，非常合適用于大規模現場檢測。

發明內容

發明目的：本發明要解決的技術問題是提供一種檢測大豆線蟲病的引物和探針。

本發明還要解決的技術問題是提供上述檢測大豆線蟲病的引物和探針在利用核酸層析試紙檢測大豆線蟲的中的應用，以提供一種具有高靈敏度和高特異性的檢測方法，實現一步操作即可對目的片段進行快速、簡便的可視化檢測，并定位出感染的線蟲種類。檢測過程無需依賴復雜的儀器設備，特別適合即時檢驗和大面積普查等。

技術方案：為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種檢測大豆線蟲病的引物和探針，包括如下核苷酸序列：

(1)檢測線蟲病的PCR引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)檢測胞囊線蟲的探針：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；