[發(fā)明專利]一種檢測(cè)大豆線蟲(chóng)的引物和探針及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010757312.2
• 申請(qǐng)日: 2020-07-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111662991A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳驍軼;王斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6804;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 丁靜靜

1.一種檢測(cè)大豆線蟲(chóng)的引物和探針，其特征在于，包括如下核苷酸序列：

(1)檢測(cè)線蟲(chóng)病的PCR引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)檢測(cè)胞囊線蟲(chóng)的探針：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(3)檢測(cè)結(jié)線蟲(chóng)的探針：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求檢測(cè)大豆線蟲(chóng)的引物和探針，其特征在于，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的3’端修飾Biotin；

SEQ ID NO：3所示序列的5’端修飾FITC；

SEQ ID NO：4所示序列的5’端修飾DIG。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)大豆線蟲(chóng)的引物和探針，其特征在于，所述的大豆線蟲(chóng)包括：Heterodera glycines、Heterodera sojae、Meloidogyne incognita、Meloidogynejavanica、Meloidogyne arenaria。

4.權(quán)利要求1或2所述檢測(cè)大豆線蟲(chóng)的引物和探針在制備大豆線蟲(chóng)檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

5.一種檢測(cè)大豆線蟲(chóng)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)樣品的核糖體DNA；

(2)以步驟(1)提取的DNA為模板、SEQ ID NO：1～2所示的序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，SEQ ID NO：1～2所示的序列的3’端修飾Biotin；

(3)向步驟(2)得到的PCR產(chǎn)物中分別加入SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的探針，其中SEQ ID NO：3所述序列的3’端修飾FITC，SEQ ID NO：4所示序列的3’端修飾DIG，梯度退火雜交；

(4)將步驟(3)得到的雜交液與展開(kāi)液混合，滴在大豆線蟲(chóng)病的核酸層析試紙上，所述大豆線蟲(chóng)病的核酸層析試紙上設(shè)有檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、質(zhì)控線，其中檢測(cè)線1噴涂抗FITC的抗體，檢測(cè)線2噴涂抗DIG的抗體，質(zhì)控線噴涂生物素；

(5)若質(zhì)控線、檢測(cè)線1顯色，檢測(cè)線2不顯色，則判定待測(cè)樣品中含有大豆胞囊線蟲(chóng)；

若質(zhì)控線、檢測(cè)線2顯色，檢測(cè)線1不顯色，則判定待測(cè)樣品中含有大豆根結(jié)線蟲(chóng)；

若質(zhì)控線顯色，檢測(cè)線1、檢測(cè)線2不顯色，則判定待測(cè)樣品中不含有大豆胞囊線蟲(chóng)或大豆根結(jié)線蟲(chóng)；

若質(zhì)控線不顯色，判定結(jié)果無(wú)效。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)大豆線蟲(chóng)的方法，其特征在于，步驟(2)中，PCR體系如下：1μL DNA、2μL dNTP、2μL DreamTaq緩沖液、0.3μL Dream Taq、SEQ ID NO:1和2所示的引物各1μL、13μL雙蒸水；

PCR條件如下：94℃變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min，冷卻至12℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)大豆線蟲(chóng)病的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的核酸層析試紙包括：樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、層析膜(3)、吸收墊(7)、固定板(8)；所述的樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、層析膜(3)、吸收墊(7)通過(guò)壓敏粘合劑依次組裝在固定板(8)上；

所述的樣品墊(1)是檢測(cè)樣品的滴加位置，其材質(zhì)為纖維素，制作核酸層析試紙前將樣品墊置于樣品墊處理液中靜置10min，取出后置37℃烘干，密閉保存?zhèn)溆茫龅臉悠穳|處理液的配方如下體積分?jǐn)?shù)的物質(zhì)：0.5％Tritonx-100、0.5％BSA、1％Tween-20溶于0.01M的PBS，調(diào)至PH8.0；

所述的結(jié)合墊(2)為膠體金結(jié)合墊，所述的膠體金結(jié)合墊的材質(zhì)是玻璃纖維，制作前將結(jié)合墊置于鏈霉親和素修飾的納米金顆粒中的浸涂，然后37℃烘干備用；

所述的層析膜(3)的材質(zhì)是高分子硝酸纖維素膜，層析膜(3)上噴涂有檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、質(zhì)控線，其中檢測(cè)線1噴涂抗FITC的抗體，檢測(cè)線2噴涂抗DIG的抗體，質(zhì)控線噴涂生物素，其中所述檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、質(zhì)控線間間距0.6cm；

所述的吸收墊(7)用于吸收檢測(cè)后的樣本，其材質(zhì)為纖維素，

所述的固定板(8)為樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、層析膜(3)、吸收墊的(7)背襯底板。