[發(fā)明專利]火龍果種質(zhì)資源SSR指紋數(shù)據(jù)庫(kù)及鑒定體系的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010750345.4
• 申請(qǐng)日: 2020-07-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111876515A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 武志江;鄧海燕;黃黎芳;梁桂東;陸貴鋒;黃鳳珠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發(fā)明屬于火龍果種質(zhì)資源鑒定技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種火龍果種質(zhì)資源SSR指紋數(shù)據(jù)庫(kù)及鑒定體系的構(gòu)建方法，包括：分別提取火龍果RNA、建立cDNA文庫(kù)并測(cè)序定位SSR標(biāo)記；EST?SSR引物設(shè)計(jì)與篩選；優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，并結(jié)合經(jīng)設(shè)計(jì)與篩選得到的EST?SSR引物進(jìn)行EST?SSR多態(tài)性分析；依次進(jìn)行SSR標(biāo)記測(cè)序驗(yàn)證和SSR?PCR擴(kuò)增；依次進(jìn)行毛細(xì)血管電泳檢測(cè)、火龍果指紋圖譜的構(gòu)建和火龍果種質(zhì)鑒定技術(shù)體系的制定。本發(fā)明根據(jù)每對(duì)引物擴(kuò)增的等位基因片段大小以及0/1代碼轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了每份種質(zhì)的指紋圖譜；集成相關(guān)試驗(yàn)技術(shù)研究結(jié)果，建立了火龍果EST?SSR分子標(biāo)記種質(zhì)鑒定技術(shù)體系。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于火龍果種質(zhì)資源鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種火龍果種質(zhì)資源SSR指紋數(shù)據(jù)庫(kù)及鑒定體系的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

目前，據(jù)2019年最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)火龍果種植面積已發(fā)展到5.33萬(wàn)hm²余，主要集中在南方地區(qū)，包括廣西、廣東、海南、貴州、云南、福建、臺(tái)灣等熱帶南亞熱帶地區(qū)。然而，由于品種鑒定體系標(biāo)準(zhǔn)和市場(chǎng)監(jiān)管的缺失，火龍果種苗流通中存在品種混亂、隨意命名、同物異名或異物同名等現(xiàn)象，嚴(yán)重侵犯了育種者和生產(chǎn)者的合法權(quán)益，對(duì)火龍果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展不利，因此，能否有效鑒定和區(qū)分不同品種是維護(hù)品種權(quán)亟待解決的基本問(wèn)題。量天尺屬(火龍果)已于2019年4月1日列入第十一批植物新品種保護(hù)名錄，而火龍果的品種鑒定及品種權(quán)利保護(hù)尚未建立相對(duì)統(tǒng)一的方法體系。由此可見(jiàn)，構(gòu)建火龍果品種鑒定技術(shù)體系標(biāo)準(zhǔn)和分子身份證數(shù)據(jù)庫(kù)勢(shì)在必行

通過(guò)全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)信息公共服務(wù)平臺(tái)檢索，目前現(xiàn)行的品種鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)主要包括DUS測(cè)試和分子標(biāo)記法。而DUS測(cè)試在品種鑒定的使用上存在成本高、周期長(zhǎng)且受環(huán)境或人為因素影響等諸多問(wèn)題。至截稿前，火龍果DUS測(cè)試指南的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)仍未頒布。DNA分子標(biāo)記中，早期RAPD、ISSR、RFLP、AFLP等標(biāo)記因其具有分型不穩(wěn)定、基因型過(guò)多無(wú)法分辨、非共顯性等缺陷，沒(méi)有納入品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)在BMP測(cè)試指南草案中，將SSR和SNP分子標(biāo)記納入適合構(gòu)建品種分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)的兩項(xiàng)技術(shù)，其中SSR標(biāo)記鑒定技術(shù)較成熟，成為品種建庫(kù)的首選標(biāo)記。熒光標(biāo)記SSR毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)因其測(cè)序精準(zhǔn)高效、重復(fù)性好、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于大批量品種的檢測(cè)分析，被廣泛應(yīng)用于各類作物的品種鑒定、分子身份證構(gòu)建及品種權(quán)保護(hù)等研究。目前有關(guān)火龍果SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的文獻(xiàn)報(bào)道較少，主要用于遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析上，且不同的研究者所保存的種質(zhì)資源在數(shù)量和種類上存在較大差異。另外，利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建火龍果種質(zhì)資源SSR指紋數(shù)據(jù)庫(kù)及鑒定體系的研究迄今未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

通過(guò)上述分析，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題及缺陷為：

(1)DNA分子標(biāo)記中，早期RAPD、ISSR、RFLP、AFLP等標(biāo)記因其具有分型不穩(wěn)定、基因型過(guò)多無(wú)法分辨、非共顯性等缺陷。

(2)目前有關(guān)火龍果SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的文獻(xiàn)報(bào)道較少，主要用于遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析上，且不同的研究者所保存的種質(zhì)資源在數(shù)量和種類上存在較大差異。

(3)用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建火龍果種質(zhì)資源SSR指紋數(shù)據(jù)庫(kù)及鑒定體系的研究迄今未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

解決以上問(wèn)題及缺陷的難度為：提高基因分型的靈敏度和精準(zhǔn)度，是解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題及缺陷的難度。

解決以上問(wèn)題及缺陷的意義為：利用熒光標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記的共顯性、高分辨度和重復(fù)性，以區(qū)分基因類型及辨別精準(zhǔn)性和重復(fù)性。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種火龍果種質(zhì)資源SSR指紋數(shù)據(jù)庫(kù)及鑒定體系的構(gòu)建方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種火龍果種質(zhì)資源SSR指紋數(shù)據(jù)庫(kù)及鑒定體系的構(gòu)建方法，所述火龍果種質(zhì)資源SSR指紋數(shù)據(jù)庫(kù)及鑒定體系的構(gòu)建方法包括以下步驟：

步驟一，分別提取火龍果RNA、建立cDNA文庫(kù)并測(cè)序定位SSR標(biāo)記。