[發明專利]火龍果種質資源SSR指紋數據庫及鑒定體系的構建方法

在審

• 申請號: 202010750345.4
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111876515A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 武志江;鄧海燕;黃黎芳;梁桂東;陸貴鋒;黃鳳珠
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種火龍果種質資源SSR指紋數據庫及鑒定體系的構建方法，其特征在于，所述火龍果種質資源SSR指紋數據庫及鑒定體系的構建方法包括以下步驟：

步驟一，分別提取火龍果RNA、建立cDNA文庫并測序定位SSR標記；

步驟二，EST-SSR引物設計：選取SSR位點側翼序列長度大于50bp的Unigenes序列，使用primer 3.0設計EST-SSR引物；

步驟三，EST-SSR引物篩選：根據引物篩選標準選取EST-SSR引物，取3個形態顯著不同的種質通過2％瓊脂糖凝膠電泳對引物進行初篩；選擇8個的火龍果品種通過2％瓊脂糖凝膠電泳進行復篩；

步驟四，優化PCR反應體系，并結合經設計與篩選得到的EST-SSR引物進行EST-SSR多態性分析；

步驟五，依次進行SSR標記測序驗證和SSR-PCR擴增；

步驟六，依次進行毛細血管電泳檢測、火龍果指紋圖譜的構建和火龍果種質鑒定技術體系制定。

2.如權利要求1所述的火龍果種質資源SSR指紋數據庫及鑒定體系的構建方法，其特征在于，步驟六中，所述火龍果種質鑒定技術體系的建立方法，包括：

(1)取樣：采集為扦插苗、實生苗等嫩莖作為檢測樣品；

(2)樣品保存：選取適量的樣品，裝入EP管，液氮速凍，置于-80℃的冰箱中保存待測；

(3)提取DNA，構建PCR反應體系并設置PCR反應程序；

(4)分別進行毛細管電泳檢測、數據分析及結果判定。

3.如權利要求2所述的火龍果種質資源SSR指紋數據庫及鑒定體系的構建方法，其特征在于，步驟(3)中，所述提取DNA的方法為：

1)每個火龍果嫩莖樣品取0.1～0.2g，放置2mL EP管中，剪碎，加入1mL含1％巰基乙醇的CTAB裂解液；組織研磨儀研磨2min；

2)研磨后的樣品放入65℃水浴裂解60min，其間振蕩混勻2～3次；

3)12000rpm離心5min，吸取800μL上清轉入新的2mL離心管中，每管樣品加入200μL20％PVP40，混合均勻；分別加入300μLTris飽和酚，300μL氯仿劇烈震蕩混勻，室溫放置10min；

4)12000rpm離心10min，吸取上清；

5)重復步驟3.1、步驟3.4兩次；

6)上清加入按照1:1加入氯仿劇烈震蕩混勻，室溫放置10min；

7)12000rpm離心10min，吸取上清；加入1/103M NaAC和0.8倍體積的異丙醇沉淀DNA；

8)12000rpm離心10min，沉淀用70％乙醇洗兩遍，晾干；200～500μL含有RNase的TE溶解DNA。

4.如權利要求2所述的火龍果種質資源SSR指紋數據庫及鑒定體系的構建方法，其特征在于，步驟(4)中，所述毛細血管電泳檢測的方法，包括：

(I)將高度去離子甲酰胺HIDI溶液與LIZ500分子量內標以100：1的體積比混勻；

(II)取9μL加入96孔板中，再加入1μL稀釋10倍的PCR擴增產物；

(III)使用ABI3730XL測序儀進行毛細管電泳，得到毛細管原始數據，即FASTA文件。

5.如權利要求2所述的火龍果種質資源SSR指紋數據庫及鑒定體系的構建方法，其特征在于，步驟(4)中，所述對數據進行分析的方法為：

a)利用GeneMarker對原始數據進行分析，根據各泳道內分子量內標的位置與各樣品峰值的位置比較分析，確定待測樣品的片段大小；

b)根據每對引物擴增出的等位基因片段大小，按“有”對應電泳峰記為“1”，“無”記為“0”的方法，最終由一系列0/1數字表示，形成一個0/1代碼的SSR指紋圖譜。

6.如權利要求2所述的火龍果種質資源SSR指紋數據庫及鑒定體系的構建方法，其特征在于，步驟(4)中，所述對結果進行判定的方法為：

將待測樣品與對照樣品的SSR指紋比對結果分析；若待測品種與對照品種有等位基因不同的位點，則根據位點及其等位基因的不同，判定兩者為不同品種；若待測品種與對照品種全部位點等位基因均相同，則判定兩者為SSR指紋完全相同的品種。