[發明專利]提高蛋白表達量的信號肽及其應用

有效

• 申請號: 202010749129.8
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111808177B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 佟毅;李義;陶進;劉松;徐奎棟;李江華;陳堅
• 申請（專利權）人: 吉林中糧生化有限公司;江南大學
• 主分類號: C07K14/32
• 分類號: C07K14/32;C12N15/31;C12N15/75;C12N9/44;C07K19/00;C07K14/435;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了提高蛋白表達量的信號肽及其應用，屬于基因工程及酶工程技術領域。本發明以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)表達宿主，將枯草芽孢桿菌內源信號肽Bp、NprB、YdjM分別融合至普魯蘭酶基因的N端，并將這3種信號肽進行同義突變，經發酵后選擇最有利于普魯蘭酶表達的同義突變核苷酸序列，所得到的突變后的3種信號肽序列，可使普魯蘭酶胞外酶活分別提高至改造前的4.15，2.33，1.67倍，有利于提高普魯蘭酶的胞外表達，有利于規模化生產普魯蘭酶。

技術領域

本發明涉及提高蛋白表達量的信號肽及其應用，屬于基因工程及酶工程技術領域。

背景技術

普魯蘭酶能夠專一性水解支鏈淀粉的分支，在淀粉糖化工藝中，常與葡糖淀粉酶或β-淀粉酶聯用，生產葡萄糖漿和麥芽糖漿。因此在多種工業領域(如食品、藥物中間體及飼用酶制劑等)中，都得到了廣泛的應用，是生產工藝中保障高效生產和經濟效益的重要法寶。隨著DNA重組技術的迅速發展，大量研究采用基因工程菌來表達普魯蘭酶，以期走出野生菌普魯蘭酶產量低下的困境。

枯草芽孢桿菌具有無致病性、且結構簡單、有利于蛋白質的跨膜分泌過程等特點；此外，其還有無明顯的密碼子偏好性、具有很強的蛋白分泌能力；因而被廣泛應用于基因工程技術中，用以表達蛋白。雖然前期也有通過改造普魯蘭酶本身的氨基酸組成、或利用一些信號肽誘導蛋白的表達，來提升普魯蘭酶胞外表達的活力；但是對酶本身的氨基酸組成發生改變常常會導致酶本身的催化性能受到影響，而利用信號肽雖然使得蛋白的表達量得到了提升，但普魯蘭酶的表達量依舊無法滿足工業化大規模生產的需求。

因而，需要尋找一種將普魯蘭酶胞外表達量得到進一步提升的同時，又不改變酶本身性能的方法，以適應普魯蘭酶規模化生產的需求。

發明內容

為解決目前存在的問題，本發明通過對信號肽N端編碼區(NCS)進行同義突變，在確保蛋白翻譯不受影響的情況，篩選出能顯著提高蛋白表達量的信號肽，為蛋白的高效表達提供了一種新方法。

本發明提供了一類信號肽，所述信號肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示任一。

本發明提供一種提高枯草芽孢桿菌胞外蛋白表達量的方法，在編碼蛋白的核苷酸序列的N端添加核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信號肽。

在本發明的一種實施方式中，在目的蛋白的N端添加核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信號肽，并構建重組質粒，將重組質粒導入枯草芽孢桿菌。

在本發明的一種實施方式中，將核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信號肽添加至編碼目的蛋白的核苷酸序列的起始密碼子ATG后。

在本發明的一種實施方式中，所述目的蛋白為普魯蘭酶和/或sfGFP。

在本發明的一種實施方式中，所述普魯蘭酶氨基酸序列的NCBI登錄號為AMQ67157，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本發明的一種實施方式中，編碼所述sfGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本發明提供了含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信號肽的重組質粒。

在本發明的一種實施方式中，所述重組質粒上含有組成型或誘導型啟動子。

在本發明的一種實施方式中，所述組成型或誘導型啟動子為能夠在枯草芽孢桿菌中表達的啟動子。

在本發明的一種實施方式中，所述啟動子包括LytR啟動子，核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在本發明的一種實施方式中，所述重組質粒以任意能在枯草芽孢桿菌中表達的表達質粒為出發載體。

在本發明的一種實施方式中，所述出發載體包括P43NMK。