[發(fā)明專利]一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010749121.1
• 申請日: 2020-07-30
• 公開（公告）號: CN111676299A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李碧春;石祥;左其生;張亞妮;孫紅艷
• 申請（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6869
• 代理公司: 揚(yáng)州蘇中專利事務(wù)所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

本發(fā)明涉及一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法，包括以下步驟：（1）消毒；取剛產(chǎn)出體外的新鮮受精蛋，使用1%新潔爾滅清洗蛋殼，再用75%酒精擦拭蛋殼表明進(jìn)行消毒；（2）取樣；在超凈臺中藥勺法取出新鮮受精蛋的胚盤，PBS清洗三遍，用移液槍輕輕吹勻，制備成單細(xì)胞懸液；（3）單細(xì)胞測序儀器進(jìn)行上機(jī)建庫；（4）對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；（5）細(xì)胞亞群的鑒定。通過本發(fā)明，可以準(zhǔn)確的鑒定胚盤中細(xì)胞的種類，與傳統(tǒng)的測序方式不同，單細(xì)胞測序可以檢測細(xì)胞之間的異質(zhì)性，在單個細(xì)胞水平上，對基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進(jìn)行高通量測序分析，在相關(guān)研究中具有極高的準(zhǔn)確性和可信度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法，屬于生物技術(shù)、設(shè)計(jì)動物組織與細(xì)胞工程等領(lǐng)域。

背景技術(shù)

BCs（雞囊胚細(xì)胞）作為潛在的胚胎干細(xì)胞，在胚胎發(fā)育動物模型、家禽種質(zhì)資源的保存以及家禽轉(zhuǎn)基因技術(shù)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。并且雞胚作為經(jīng)典的胚胎生物學(xué)模型，價格低廉且容易獲得，因此雞胚胚盤細(xì)胞在動物發(fā)育模型（如細(xì)胞的起源與分化）上具有廣泛的應(yīng)用前景。Eyal-Giladi等將第一次卵裂到雞胚原條形成的這段早期發(fā)育階段分為I-XIV期，當(dāng)雞蛋剛產(chǎn)出體外時已發(fā)育至囊胚期，此時胚盤中有大約50000-60000個細(xì)胞，但其中的細(xì)胞種類未有詳細(xì)的研究。隨著技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞測序技術(shù)（single cellsequencing）越來越多應(yīng)用到細(xì)胞的分析研究中。單細(xì)胞測序技術(shù)是指在單個細(xì)胞水平上，對基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進(jìn)行高通量測序分析的一項(xiàng)新技術(shù)，它能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)高通量測序的局限性，揭示單個細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性。這項(xiàng)技術(shù)剛好可以解決這個問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有問題，提供一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法，其特征是，包括以下步驟：

（1）消毒；取剛產(chǎn)出體外的新鮮受精蛋，使用1%新潔爾滅清洗蛋殼，再用75%酒精擦拭蛋殼表明進(jìn)行消毒；

（2）取樣；在超凈臺中藥勺法取出新鮮受精蛋的胚盤，PBS清洗三遍，用移液槍輕輕吹勻，制備成單細(xì)胞懸液；

（3）單細(xì)胞測序儀器進(jìn)行上機(jī)建庫；將單細(xì)胞懸液加入單細(xì)胞測序儀器的上樣孔中，開機(jī)后單細(xì)胞懸液中每個細(xì)胞和微粒一起在儀器中會被單個油滴包裹，微粒上面有擴(kuò)增所需的引物，并且每條引物以及每個油滴都有唯一的標(biāo)記；隨后PCR擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測序，因此可以單獨(dú)檢測出每個細(xì)胞內(nèi)所有基因的表達(dá)量；

（4）對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；單個細(xì)胞的所有mRNA進(jìn)行高通量測序后，軟件分析細(xì)胞內(nèi)所有基因的表達(dá)模式，使用seurat軟件進(jìn)行主成分分析降維后，利用非線性降維算法t-sne來調(diào)整數(shù)據(jù)，將多維數(shù)據(jù)降為二維空間；經(jīng)過降維處理后，所有數(shù)據(jù)都映射到二維空間，空間上每個點(diǎn)都代表一個細(xì)胞，點(diǎn)之間的距離就是指平面上兩個點(diǎn)的直線距離，其代表著細(xì)胞之間的相似性，細(xì)胞之間越相似，他們的基因的表達(dá)模式就越接近，那么平面上顯示出來的點(diǎn)之間的距離就越近；因此點(diǎn)之間的距離可以決定是否屬于相同的細(xì)胞類型，然后用k-means算法來把細(xì)胞聚類分群；

（5）細(xì)胞亞群的鑒定；亞群分好后，需要借助標(biāo)記基因來鑒定，通過CellMarker網(wǎng)站來找到人和鼠早期胚胎中不同細(xì)胞類型的標(biāo)記基因，從現(xiàn)有的早期雞胚中不同細(xì)胞中表達(dá)的基因作為參考，通過熱圖展現(xiàn)出亞群中高表達(dá)基因的表達(dá)情況，與準(zhǔn)備好的標(biāo)記基因進(jìn)行比對，鑒定出每個亞群的細(xì)胞類型。

步驟（2）中，胚盤的分離時，將受精蛋大頭朝上拿住，使用鑷子將蛋中間部分敲開，小心的掀去上半部分蛋殼，用藥勺去除蛋黃周圍的蛋清，用消毒后的剪刀沿著胚盤周圍一圈剪開，置于裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃，當(dāng)胚盤脫落下來后用吸管輕輕吸取到干凈的裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中，重復(fù)清洗三遍。