[發(fā)明專利]一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010749121.1
• 申請(qǐng)日: 2020-07-30
• 公開（公告）號(hào): CN111676299A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李碧春;石祥;左其生;張亞妮;孫紅艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6869
• 代理公司: 揚(yáng)州蘇中專利事務(wù)所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

1.一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法，其特征是，包括以下步驟：

（1）消毒；取剛產(chǎn)出體外的新鮮受精蛋，使用1%新潔爾滅清洗蛋殼，再用75%酒精擦拭蛋殼表明進(jìn)行消毒；

（2）取樣；在超凈臺(tái)中藥勺法取出新鮮受精蛋的胚盤，PBS清洗三遍，用移液槍輕輕吹勻，制備成單細(xì)胞懸液；

（3）單細(xì)胞測序儀器進(jìn)行上機(jī)建庫；將單細(xì)胞懸液加入單細(xì)胞測序儀器的上樣孔中，開機(jī)后單細(xì)胞懸液中每個(gè)細(xì)胞和微粒一起在儀器中會(huì)被單個(gè)油滴包裹，微粒上面有擴(kuò)增所需的引物，并且每條引物以及每個(gè)油滴都有唯一的標(biāo)記；隨后PCR擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測序，因此可以單獨(dú)檢測出每個(gè)細(xì)胞內(nèi)所有基因的表達(dá)量；

（4）對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；單個(gè)細(xì)胞的所有mRNA進(jìn)行高通量測序后，軟件分析細(xì)胞內(nèi)所有基因的表達(dá)模式，使用seurat軟件進(jìn)行主成分分析降維后，利用非線性降維算法t-sne來調(diào)整數(shù)據(jù)，將多維數(shù)據(jù)降為二維空間；經(jīng)過降維處理后，所有數(shù)據(jù)都映射到二維空間，空間上每個(gè)點(diǎn)都代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)之間的距離就是指平面上兩個(gè)點(diǎn)的直線距離，其代表著細(xì)胞之間的相似性，細(xì)胞之間越相似，他們的基因的表達(dá)模式就越接近，那么平面上顯示出來的點(diǎn)之間的距離就越近；因此點(diǎn)之間的距離可以決定是否屬于相同的細(xì)胞類型，然后用k-means算法來把細(xì)胞聚類分群；

（5）細(xì)胞亞群的鑒定；亞群分好后，需要借助標(biāo)記基因來鑒定，通過CellMarker網(wǎng)站來找到人和鼠早期胚胎中不同細(xì)胞類型的標(biāo)記基因，從現(xiàn)有的早期雞胚中不同細(xì)胞中表達(dá)的基因作為參考，通過熱圖展現(xiàn)出亞群中高表達(dá)基因的表達(dá)情況，與準(zhǔn)備好的標(biāo)記基因進(jìn)行比對(duì)，鑒定出每個(gè)亞群的細(xì)胞類型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法，其特征是，步驟（2）中，胚盤的分離時(shí)，將受精蛋大頭朝上拿住，使用鑷子將蛋中間部分敲開，小心的掀去上半部分蛋殼，用藥勺去除蛋黃周圍的蛋清，用消毒后的剪刀沿著胚盤周圍一圈剪開，置于裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃，當(dāng)胚盤脫落下來后用吸管輕輕吸取到干凈的裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中，重復(fù)清洗三遍。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法，其特征是，步驟（2）中，單細(xì)胞懸液的制備時(shí)，吸取3個(gè)上一步清洗好的胚盤到1.5ml的EP管中，用移液槍輕輕吹打10次，目測懸液中沒有聚集的塊狀物，然后用40目細(xì)胞過濾篩進(jìn)行過濾至干凈的1.5mlEP管中。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法，其特征是，步驟（3）中，還包括單細(xì)胞活性檢測，吸取20ul制備好的單細(xì)胞懸液，加入0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色10分鐘，顯微鏡下觀察并且統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的活性，活細(xì)胞概率需大于80%方可上機(jī)檢測。

5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法，其特征是，步驟（3）中，上機(jī)測序中，胚盤的單細(xì)胞懸液制備好后，加入到微流體裝置的單細(xì)胞測序儀器的上樣孔中，同時(shí)上樣的還有一種微粒，每個(gè)微粒含有超過10 的8次方個(gè)獨(dú)立的引物，它們共享相同的“PCR處理”和“細(xì)胞條形碼”，但具有不同的獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)符(UMI)；細(xì)胞條碼只在相同微粒的所有引物中相同，但與其他珠子上的細(xì)胞條碼不同，可以追溯細(xì)胞的來源；每個(gè)引物上不同的UMI允許mRNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行數(shù)字計(jì)數(shù)并識(shí)別PCR重復(fù)；一旦單細(xì)胞懸液和微粒準(zhǔn)備就緒后，微流體裝置將單個(gè)細(xì)胞與微粒一起封裝在油滴中進(jìn)行反應(yīng)；隨后通過添加試劑來破壞液滴以使油-水界面不穩(wěn)定，并且收集微粒并洗滌；然后將mRNA在一個(gè)反應(yīng)中一起逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，形成稱為“附著于微粒的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組”的(STAMP)的一組珠子；然后可以通過PCR反應(yīng)對(duì)帶有條形碼的STAMP進(jìn)行擴(kuò)增以進(jìn)行高通量mRNA測序，以分析任何期望數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定雞囊胚配盤中細(xì)胞種類的方法，其特征是，步驟（4）中，數(shù)據(jù)分析時(shí)，單個(gè)細(xì)胞的所有mRNA進(jìn)行高通量測序后，軟件分析細(xì)胞內(nèi)所有基因的表達(dá)模式，使用seurat軟件進(jìn)行主成分分析降維后，利用非線性降維算法t-sne來調(diào)整數(shù)據(jù)，將多維數(shù)據(jù)降為二維空間；在二維空間里，細(xì)胞之間的基因表達(dá)情況越相似，在圖中的距離也就越靠近；因此點(diǎn)之間的距離可以決定是否屬于相同的細(xì)胞類型，然后用k-means算法來把細(xì)胞聚類分群。